农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2014年
9期
1175-1181
,共7页
操储云%张大淦%余为一%陈芳芳
操儲雲%張大淦%餘為一%陳芳芳
조저운%장대감%여위일%진방방
恒定链基因(Ii)%慢病毒重组载体%基因沉默%感染效率
恆定鏈基因(Ii)%慢病毒重組載體%基因沉默%感染效率
항정련기인(Ii)%만병독중조재체%기인침묵%감염효솔
Invariant chain gene(Ii)%Recombinant lentiviral vectors%Gene silencing%Infection efficiency
恒定链(invariant chain,Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用.为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系,本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体,并比较了其干扰效果.首先,用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列,分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7.4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定,分别命名为pLL-Ii-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539.然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系),进行病毒包装,再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11.结果表明,重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白,用包装的慢病毒接种293T细胞,其滴度达2.2× 107～5.1×107 TU/mL;接种HD-11细胞的感染率均达到95％以上.最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率,与对照组相比,4个重组慢病毒干扰效率分别为37％、52％、88％和78％;其中,pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高.综上所述,本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体,并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键.实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料.
恆定鏈(invariant chain,Ii)是脊椎動物重要的免疫分子,在主要組織相容性複閤體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子遞呈抗原中起重要作用.為研究鷄(Gus gallus)Ii與MHCⅡ類分子的關繫,本研究構建瞭4箇沉默Ii基因的慢病毒錶達載體,併比較瞭其榦擾效果.首先,用自行設計閤成的4條鷄Ii基因榦擾序列,分彆經一步退火法穫得雙鏈短髮夾RNA(short hairpin RNA,shRNA),併將其用雙酶切法插入慢病毒載體pLL3.7.4箇構建的慢病毒重組載體經酶切和測序鑒定,分彆命名為pLL-Ii-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539.然後把這些重組載體分彆轉染293T細胞(轉染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人腎上皮細胞繫),進行病毒包裝,再用包裝的慢病毒感染鷄源巨噬細胞HD-11.結果錶明,重組載體感染的293T細胞錶達綠色熒光蛋白,用包裝的慢病毒接種293T細胞,其滴度達2.2× 107～5.1×107 TU/mL;接種HD-11細胞的感染率均達到95％以上.最後用熒光定量PCR方法檢測其沉默鷄源巨噬細胞HD-11的鷄Ii mRNA的效率,與對照組相比,4箇重組慢病毒榦擾效率分彆為37％、52％、88％和78％;其中,pLL-Ii-shRNA527的榦擾效率最高.綜上所述,本研究從4箇構建的重組載體中篩選齣1箇高效沉默鷄巨噬細胞Ii基因重組載體,併提示shRNA序列是決定沉默特定基因的關鍵.實驗結果為研究鷄Ii在遞呈抗原中與其他免疫分子的關繫提供瞭基礎資料.
항정련(invariant chain,Ii)시척추동물중요적면역분자,재주요조직상용성복합체(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ류분자체정항원중기중요작용.위연구계(Gus gallus)Ii여MHCⅡ류분자적관계,본연구구건료4개침묵Ii기인적만병독표체재체,병비교료기간우효과.수선,용자행설계합성적4조계Ii기인간우서렬,분별경일보퇴화법획득쌍련단발협RNA(short hairpin RNA,shRNA),병장기용쌍매절법삽입만병독재체pLL3.7.4개구건적만병독중조재체경매절화측서감정,분별명명위pLL-Ii-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527화pLL-Ii-shRNA539.연후파저사중조재체분별전염293T세포(전염선병독E1A기인(lethal infection gene)적인신상피세포계),진행병독포장,재용포장적만병독감염계원거서세포HD-11.결과표명,중조재체감염적293T세포표체록색형광단백,용포장적만병독접충293T세포,기적도체2.2× 107～5.1×107 TU/mL;접충HD-11세포적감염솔균체도95％이상.최후용형광정량PCR방법검측기침묵계원거서세포HD-11적계Ii mRNA적효솔,여대조조상비,4개중조만병독간우효솔분별위37％、52％、88％화78％;기중,pLL-Ii-shRNA527적간우효솔최고.종상소술,본연구종4개구건적중조재체중사선출1개고효침묵계거서세포Ii기인중조재체,병제시shRNA서렬시결정침묵특정기인적관건.실험결과위연구계Ii재체정항원중여기타면역분자적관계제공료기출자료.
