CAJ | 학술논문

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种急性高度接触性传染病病原,可引起犬(Canis)、猫(Felis)等多种属动物发热、腹泻、肺炎和中枢神经系统紊乱,其磷蛋白(phospho-protein,P)在病毒复制和致病中具有重要作用.本研究根据犬瘟热病毒P蛋白基因(GenBank No.AF 164967)设计引物,RT-PCR扩增得到CDV-P基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-CDV-P,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)菌株,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组his-CDV-P蛋白,His-band纯化后获得高纯度重组蛋白,纯化蛋白免疫balb/c小鼠,制备了小鼠抗CDV-P抗体,检测CDV感染细胞内P蛋白的表达和细胞定位,检测不同感染时间细胞内P蛋白的表达.SDS-PAGE电泳结果表明,获得重组蛋白的分子量大小为65 kD,表达的蛋白以包涵体形式存在,占总菌体蛋白的35％以上,纯化后占总蛋白60％以上;Western blot检测表明,小鼠抗CDV-P抗体能特异性识别原核表达产物和病毒感染表达产物,CDV-P在感染细胞内具有两种表现形式(磷酸化和非磷酸化);间接免疫荧光结果显示,该蛋白在胞浆和胞核中都存在;CDV-P在病毒感染的早期和晚期都有表达,随着感染时间延长表达逐渐增加,并且其磷酸化水平也逐渐增加.本研究制备了重组P蛋白和多克隆抗体,检测了P蛋白在感染细胞内的表达和定位,为P蛋白功能和CDV致病机理研究提供基础资料.
견온열병독(Canine distemper virus,CDV)시일충급성고도접촉성전염병병원,가인기견(Canis)、묘(Felis)등다충속동물발열、복사、폐염화중추신경계통문란,기린단백(phospho-protein,P)재병독복제화치병중구유중요작용.본연구근거견온열병독P단백기인(GenBank No.AF 164967)설계인물,RT-PCR확증득도CDV-P기인편단,아극륭도원핵표체재체pET-28(a)상,구건중조원핵표체질립pET-28(a)-CDV-P,전화대장간균(Escherichia coli) BL21(DE3)균주,이병기류대반유당감(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)유도표체중조his-CDV-P단백,His-band순화후획득고순도중조단백,순화단백면역balb/c소서,제비료소서항CDV-P항체,검측CDV감염세포내P단백적표체화세포정위,검측불동감염시간세포내P단백적표체.SDS-PAGE전영결과표명,획득중조단백적분자량대소위65 kD,표체적단백이포함체형식존재,점총균체단백적35％이상,순화후점총단백60％이상;Western blot검측표명,소서항CDV-P항체능특이성식별원핵표체산물화병독감염표체산물,CDV-P재감염세포내구유량충표현형식(린산화화비린산화);간접면역형광결과현시,해단백재포장화포핵중도존재;CDV-P재병독감염적조기화만기도유표체,수착감염시간연장표체축점증가,병차기린산화수평야축점증가.본연구제비료중조P단백화다극륭항체,검측료P단백재감염세포내적표체화정위,위P단백공능화CDV치병궤리연구제공기출자료.