农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2014年
4期
406-414
,共9页
胡广东%高元鹏%王静%郑丽明%张涌
鬍廣東%高元鵬%王靜%鄭麗明%張湧
호엄동%고원붕%왕정%정려명%장용
piggyBac (PB)转座子%转座酶%原核表达%人免疫缺陷病毒反式激活因子(TAT)穿膜肽%HEK 293细胞
piggyBac (PB)轉座子%轉座酶%原覈錶達%人免疫缺陷病毒反式激活因子(TAT)穿膜肽%HEK 293細胞
piggyBac (PB)전좌자%전좌매%원핵표체%인면역결함병독반식격활인자(TAT)천막태%HEK 293세포
piggyBac(PB) transposon%Transposase%Prokaryotic expression%Human immunodeficiency virus transactivator (TAT) peptide%HEK 293 cells
为了增加piggyBac (PB)转座系统在转基因操作中安全性和减少PB转座系统的辅助质粒带来的副作用,本研究利用N端融合人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原核表达PB转座酶替代辅助质粒在人肾胚细胞(HEK293细胞)介导PB转座的发生,同时建立一种由TAT介导的外源功能蛋白进入真核细胞的方法.构建了N端和C端分别融合TAT的PB转座酶原核表达载体(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2).利用pET28A-Pbase1载体在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中成功表达出N端含有TAT的PBase重组蛋白,纯化并对其进行蛋白定量,然后以100mg/mL的浓度加入细胞培养液中,转导进入HEK 293细胞,利用免疫荧光技术观察该酶能否进入HEK293细胞核,利用热不对称PCR (Tail-PCR)进行整合位点侧翼DNA序列检测,亚甲蓝进行阳性细胞克隆染色并利用非配对t检验统计细胞克隆数.聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定结果表明PBase在大肠杆菌中成功表达,经分析发现其主要以可溶蛋白形式存在.免疫荧光结果表明,N端融合TAT穿膜肽的PBase定位于细胞核,但是整合位点检测和转座效率统计结果表明,原核表达的PBase蛋白在HEK 293细胞中无法介导转座事件的发生.该转座系统能否在其他真核细胞中正常发挥作用,还需要进一步的研究.然而,本研究为由TAT穿膜肽介导的外源蛋白在真核细胞中的跨膜转运提供了一种可靠的方法.
為瞭增加piggyBac (PB)轉座繫統在轉基因操作中安全性和減少PB轉座繫統的輔助質粒帶來的副作用,本研究利用N耑融閤人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原覈錶達PB轉座酶替代輔助質粒在人腎胚細胞(HEK293細胞)介導PB轉座的髮生,同時建立一種由TAT介導的外源功能蛋白進入真覈細胞的方法.構建瞭N耑和C耑分彆融閤TAT的PB轉座酶原覈錶達載體(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2).利用pET28A-Pbase1載體在大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中成功錶達齣N耑含有TAT的PBase重組蛋白,純化併對其進行蛋白定量,然後以100mg/mL的濃度加入細胞培養液中,轉導進入HEK 293細胞,利用免疫熒光技術觀察該酶能否進入HEK293細胞覈,利用熱不對稱PCR (Tail-PCR)進行整閤位點側翼DNA序列檢測,亞甲藍進行暘性細胞剋隆染色併利用非配對t檢驗統計細胞剋隆數.聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot鑒定結果錶明PBase在大腸桿菌中成功錶達,經分析髮現其主要以可溶蛋白形式存在.免疫熒光結果錶明,N耑融閤TAT穿膜肽的PBase定位于細胞覈,但是整閤位點檢測和轉座效率統計結果錶明,原覈錶達的PBase蛋白在HEK 293細胞中無法介導轉座事件的髮生.該轉座繫統能否在其他真覈細胞中正常髮揮作用,還需要進一步的研究.然而,本研究為由TAT穿膜肽介導的外源蛋白在真覈細胞中的跨膜轉運提供瞭一種可靠的方法.
위료증가piggyBac (PB)전좌계통재전기인조작중안전성화감소PB전좌계통적보조질립대래적부작용,본연구이용N단융합인면역결함병독반식격활인자(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)천막태적원핵표체PB전좌매체대보조질립재인신배세포(HEK293세포)개도PB전좌적발생,동시건립일충유TAT개도적외원공능단백진입진핵세포적방법.구건료N단화C단분별융합TAT적PB전좌매원핵표체재체(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2).이용pET28A-Pbase1재체재대장간균(Escherichia coli) BL21 (DE3)중성공표체출N단함유TAT적PBase중조단백,순화병대기진행단백정량,연후이100mg/mL적농도가입세포배양액중,전도진입HEK 293세포,이용면역형광기술관찰해매능부진입HEK293세포핵,이용열불대칭PCR (Tail-PCR)진행정합위점측익DNA서렬검측,아갑람진행양성세포극륭염색병이용비배대t검험통계세포극륭수.취병희선알응효전영화Western blot감정결과표명PBase재대장간균중성공표체,경분석발현기주요이가용단백형식존재.면역형광결과표명,N단융합TAT천막태적PBase정위우세포핵,단시정합위점검측화전좌효솔통계결과표명,원핵표체적PBase단백재HEK 293세포중무법개도전좌사건적발생.해전좌계통능부재기타진핵세포중정상발휘작용,환수요진일보적연구.연이,본연구위유TAT천막태개도적외원단백재진핵세포중적과막전운제공료일충가고적방법.
