CAJ | 학술논문

目的观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法.方法脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇.从脐带分离得到的hUC-MSC培养传代,取第3代细胞.根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):胎牛血清(fetal bovine serum,FBS):低糖杜氏培养基(low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium,LG-DMEM)为1∶2∶7,B组为DMSO:FBS:LG-DMEM为1∶5∶4,C组为DMSO∶ FBS为1∶9,不含LG-DMEM.经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC-MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记.结果 A、B、C三组的细胞存活率分别为(20±4)％、(71±8)％和(85±7)％.与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义(均为P ＜0.05).细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC-MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义(P＞0.05);B组hUC-MSC在24 h、48 h、72 h细胞生长差异无统计学意义(P＞0.05),在96 h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);而A组hUC-MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义(均为P＜0.05).形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形.A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC-MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达阴性,CD105、CD90、CD44表达阳性.结论含高浓度血清的冻存液适合hUC-MSC的长期保存,含90％ FBS的冻存液为hUC-MSC的最佳冻存保护液.
목적 관찰불동동존액대인제대간충질간세포(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)동존복소후생물학특성적영향,우화동존방법.방법 제대취자2011년1월지2011년12월재중산대학부속제삼의원산과부궁산적족월건강산부.종제대분리득도적hUC-MSC배양전대,취제3대세포.근거동존액불동분위3조,A조동존액위이갑기아풍(dimethyl sulfoxide,DMSO):태우혈청(fetal bovine serum,FBS):저당두씨배양기(low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium,LG-DMEM)위1∶2∶7,B조위DMSO:FBS:LG-DMEM위1∶5∶4,C조위DMSO∶ FBS위1∶9,불함LG-DMEM.경동존12개월,복소세포,이제3대미동존세포현액작위대조조,채용태반람염색법비교hUC-MSC적세포존활솔,채용새서람(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)법비교세포적생장정황회제생장곡선,도치현미경하관찰세포적생장상황,채용류식세포의검측각조세포적표면표기.결과 A、B、C삼조적세포존활솔분별위(20±4)％、(71±8)％화(85±7)％.여C조비교,A조화B조적세포존활솔강저,차이유통계학의의(균위P ＜0.05).세포생장곡선현시,여대조조상비,C조hUC-MSC재각시간점세포생장신속,단차이무통계학의의(P＞0.05);B조hUC-MSC재24 h、48 h、72 h세포생장차이무통계학의의(P＞0.05),재96 h시간점생장속솔저우대조조,차이유통계학의의(P＜0.05);이A조hUC-MSC재각개시간점세포생장감만,차이유통계학의의(균위P＜0.05).형태학관찰현시,A조세포포체관대다각,병차교다분지,B조화C조세포포만,절광성호,정장사형、방추형혹다각형.A조세포복소후세포수목과소무법진행표면표기,B조화C조hUC-MSC표면표기물CD31、CD34、CD45、인류백세포항원(HLA)-DR표체음성,CD105、CD90、CD44표체양성.결론 함고농도혈청적동존액괄합hUC-MSC적장기보존,함90％ FBS적동존액위hUC-MSC적최가동존보호액.