南方农业学报
南方農業學報
남방농업학보
GUANGXI AGRICULTURAL SCIENCES
2013年
8期
1372-1376
,共5页
PK15细胞%cDNA%T7噬菌体展示文库%构建%鉴定
PK15細胞%cDNA%T7噬菌體展示文庫%構建%鑒定
PK15세포%cDNA%T7서균체전시문고%구건%감정
PK15 cells%cDNA%T7 phage display library%construction%identification
[目的]构建PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础.[方法]分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接头,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNA T7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量.[结果]经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度达6.0× 1010 PFU/mL.PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95.83％,且插入片段主要分布于500～2000 bp,其中500～750 bp的占21.73％,750～100 bp的占21.73％,1000～2000 bp的占39.13％.随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列.[结论]构建的PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用.
[目的]構建PK15細胞cDNA T7噬菌體展示文庫,為研究豬源病毒與宿主細胞的相互作用奠定基礎.[方法]分離純化PK15細胞mRNA,先後閤成第一鏈和第二鏈cDNA,經平末耑脩飾後,定嚮導入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接頭,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切消化,與噬菌體載體臂相連,然後用噬菌體包裝抽提物進行體外包裝,形成初級cDNA T7噬菌體展示文庫,併通過滴度測定和PCR鑒定文庫質量.[結果]經噬斑試驗鑒定,初級文庫滴度為2.0×105 PFU/mL,擴增後滴度達6.0× 1010 PFU/mL.PCR鑒定結果顯示,文庫的重組率為95.83％,且插入片段主要分佈于500～2000 bp,其中500～750 bp的佔21.73％,750～100 bp的佔21.73％,1000～2000 bp的佔39.13％.隨機挑選20箇剋隆進行測序,髮現均為豬源序列.[結論]構建的PK15細胞cDNA T7噬菌體展示文庫具備較高庫容量和重組率,質量良好,符閤後續文庫篩選的要求,可用于研究豬源病毒蛋白與PK15細胞的相互作用.
[목적]구건PK15세포cDNA T7서균체전시문고,위연구저원병독여숙주세포적상호작용전정기출.[방법]분리순화PK15세포mRNA,선후합성제일련화제이련cDNA,경평말단수식후,정향도입EcoRⅠ화Hind Ⅲ접두,재유EcoR Ⅰ화Hind Ⅲ쌍매절소화,여서균체재체비상련,연후용서균체포장추제물진행체외포장,형성초급cDNA T7서균체전시문고,병통과적도측정화PCR감정문고질량.[결과]경서반시험감정,초급문고적도위2.0×105 PFU/mL,확증후적도체6.0× 1010 PFU/mL.PCR감정결과현시,문고적중조솔위95.83％,차삽입편단주요분포우500～2000 bp,기중500～750 bp적점21.73％,750～100 bp적점21.73％,1000～2000 bp적점39.13％.수궤도선20개극륭진행측서,발현균위저원서렬.[결론]구건적PK15세포cDNA T7서균체전시문고구비교고고용량화중조솔,질량량호,부합후속문고사선적요구,가용우연구저원병독단백여PK15세포적상호작용.
