植物病理学报
植物病理學報
식물병이학보
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA
2013年
5期
467-474
,共8页
耿显胜%田国忠%宋传生%胡佳续%林彩丽
耿顯勝%田國忠%宋傳生%鬍佳續%林綵麗
경현성%전국충%송전생%호가속%림채려
泡桐丛枝病%植原体%茶翅蝽%原核表达%免疫印迹
泡桐叢枝病%植原體%茶翅蝽%原覈錶達%免疫印跡
포동총지병%식원체%다시춘%원핵표체%면역인적
Paulownia witches'-broom%phytoplasma%Halyomorpha haly%prokaryotic expression%Western blot
利用含泡桐丛枝植原体质粒pPaWBNy-1的3.0kb片段的克隆为模板,PCR扩增pPaWBNy-1-ORF5的亲水性肽段编码区.目的片段连接到原核表达载体pET28a(+),重组质粒pET28a-ORF5-5转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosseta (DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD600=0.52),添加IPTG诱导5h后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为15 kDa的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到表达.切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接ELISA法测定抗血清的效价约为1∶8 100.用制备的ORF5编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为17 kDa的特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测pPaWBNy-1-ORF5蛋白与介体昆虫传播植原体有关.
利用含泡桐叢枝植原體質粒pPaWBNy-1的3.0kb片段的剋隆為模闆,PCR擴增pPaWBNy-1-ORF5的親水性肽段編碼區.目的片段連接到原覈錶達載體pET28a(+),重組質粒pET28a-ORF5-5轉化大腸桿菌(Escherichia coli)Rosseta (DE3)感受態細胞,菌液處在對數生長期時(OD600=0.52),添加IPTG誘導5h後收集菌體,提取蛋白併進行聚丙烯酰胺凝膠電泳.用六聚組氨痠標籤抗體進行Western blot檢測,髮現分子量約為15 kDa的含多聚組氨痠標籤的目的蛋白得到錶達.切膠迴收融閤蛋白,免疫德國大白兔以製備抗血清,間接ELISA法測定抗血清的效價約為1∶8 100.用製備的ORF5編碼蛋白的抗血清進行Western blot分析,結果在帶菌的介體昆蟲茶翅蝽(Halyomorpha halys)中檢測到大小約為17 kDa的特異蛋白條帶,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及無菌茶翅蝽中均未檢測到,由此推測pPaWBNy-1-ORF5蛋白與介體昆蟲傳播植原體有關.
이용함포동총지식원체질립pPaWBNy-1적3.0kb편단적극륭위모판,PCR확증pPaWBNy-1-ORF5적친수성태단편마구.목적편단련접도원핵표체재체pET28a(+),중조질립pET28a-ORF5-5전화대장간균(Escherichia coli)Rosseta (DE3)감수태세포,균액처재대수생장기시(OD600=0.52),첨가IPTG유도5h후수집균체,제취단백병진행취병희선알응효전영.용륙취조안산표첨항체진행Western blot검측,발현분자량약위15 kDa적함다취조안산표첨적목적단백득도표체.절효회수융합단백,면역덕국대백토이제비항혈청,간접ELISA법측정항혈청적효개약위1∶8 100.용제비적ORF5편마단백적항혈청진행Western blot분석,결과재대균적개체곤충다시춘(Halyomorpha halys)중검측도대소약위17 kDa적특이단백조대,단재건강화감병포동(Paulownia sp.)급무균다시춘중균미검측도,유차추측pPaWBNy-1-ORF5단백여개체곤충전파식원체유관.
