中华细胞与干细胞杂志（电子版）
中華細胞與榦細胞雜誌（電子版）
중화세포여간세포잡지（전자판）
CHINESE JOURNAL OF CELL AND STEM CELL
2013年
2期
87-93
,共7页
达志峰%贾英伟%丁洁%朱志祥%冯勇%韦建%梁炳生
達誌峰%賈英偉%丁潔%硃誌祥%馮勇%韋建%樑炳生
체지봉%가영위%정길%주지상%풍용%위건%량병생
肌萎缩%MuRF-1%FOXO3a%L6%去神经支配%RNA干扰%基因表达
肌萎縮%MuRF-1%FOXO3a%L6%去神經支配%RNA榦擾%基因錶達
기위축%MuRF-1%FOXO3a%L6%거신경지배%RNA간우%기인표체
目的 探讨RNAi 技术体外抑制MuRF-1 或FOXO3a 基因表达的效果,为RNAi 介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础.方法 体外培养大鼠成肌细胞系L6,将MuRF-1 和(或)FOXO3a siRNA 重组质粒在Lipofectamine 2000 介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将2 μg MuRF-1 或FOXO3a 基因siRNA 重组质粒转染L6,转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR检测siRNA重组质粒对MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制效果,使用Western 印迹检测siRNA 重组质粒对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白水平的抑制效果.用单因素方差分析方法和LSD 法进行组间比较.结果 ( 1)质粒转染后24 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率.(2)实时定量PCR分析结果显示:MuRF-1 与FOXO3a 各自的siRNA 重组质粒转染后48 h,二者干扰序列在mRNA 水平分别明显抑制了MuRF-1 和FOXO3a 的表达,抑制率达67 ﹪和54 ﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒转染后48 h,干扰序列在mRNA 水平明显抑制了MuRF-1 及FOXO3a 的表达,抑制率达61 ﹪及58 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05);转染后72 h,MuRF-1 与FOXO3a各自的siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA 的抑制率分别达79 ﹪和81 ﹪,联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA的抑制率达77 ﹪及72 ﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),与48 h 相比,抑制效应更为明显.(3)Western 印迹灰度分析结果显示:转染后48 h,干扰序列MuRF-1明显抑制了MuRF-1 蛋白的表达,抑制率达61 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P <0.05),干扰序列FOXO3a 明显抑制了FOXO3a 蛋白的表达,抑制率达46 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白表达的抑制率达64 ﹪及42 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05);转染后72 h,干扰序列MuRF-1 对MuRF-1 蛋白表达的抑制率达70 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),干扰序列FOXO3a 对FOXO3a 蛋白表达的抑制率达72 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列对MuRF-1 和FOXO3a 蛋白表达的抑制率达73 ﹪及74 ﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),与48 h 相比,抑制效应更为明显,与对mRNA 水平的影响一致.(4)MuRF-1 的siRNA 重组质粒与联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列MuRF-1 对MuRF-1 的mRNA 和蛋白抑制效果相比差异无统计学意义(P >0.05),FOXO3a 的siRNA 重组质粒与联合MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒干扰序列FOXO3a 对FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果相比差异无统计学意义(P > 0.05).结论 ( 1)RNA 干扰技术在体外能够明显抑制泛素连接酶MuRF-1 和叉头蛋白转录因子FOXO3a 基因的表达.(2)体外研究中MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒联合转染与各基因siRNA 重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果无差别.(3)活体实验中MuRF-1 与FOXO3a 两基因siRNA 重组质粒联合转染与各基因siRNA 重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑制效果尚不明确,这为RNAi 介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供了一种新的思路.
目的 探討RNAi 技術體外抑製MuRF-1 或FOXO3a 基因錶達的效果,為RNAi 介導的失神經骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎.方法 體外培養大鼠成肌細胞繫L6,將MuRF-1 和(或)FOXO3a siRNA 重組質粒在Lipofectamine 2000 介導下轉染,優化與檢測繫統的轉染效率;將2 μg MuRF-1 或FOXO3a 基因siRNA 重組質粒轉染L6,轉染後48 h與72 h,採用實時定量PCR檢測siRNA重組質粒對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑製效果,使用Western 印跡檢測siRNA 重組質粒對MuRF-1 和FOXO3a 蛋白水平的抑製效果.用單因素方差分析方法和LSD 法進行組間比較.結果 ( 1)質粒轉染後24 h,熒光顯微鏡下可見細胞中有大量明亮的綠色熒光錶達,顯示繫統有較高的轉染效率.(2)實時定量PCR分析結果顯示:MuRF-1 與FOXO3a 各自的siRNA 重組質粒轉染後48 h,二者榦擾序列在mRNA 水平分彆明顯抑製瞭MuRF-1 和FOXO3a 的錶達,抑製率達67 ﹪和54 ﹪,與對照組相比差異均有統計學意義(P < 0.05),聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒轉染後48 h,榦擾序列在mRNA 水平明顯抑製瞭MuRF-1 及FOXO3a 的錶達,抑製率達61 ﹪及58 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05);轉染後72 h,MuRF-1 與FOXO3a各自的siRNA 重組質粒榦擾序列對MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA 的抑製率分彆達79 ﹪和81 ﹪,聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒榦擾序列對MuRF-1 和FOXO3a 的mRNA的抑製率達77 ﹪及72 ﹪,與對照組相比差異均有統計學意義(P < 0.05),與48 h 相比,抑製效應更為明顯.(3)Western 印跡灰度分析結果顯示:轉染後48 h,榦擾序列MuRF-1明顯抑製瞭MuRF-1 蛋白的錶達,抑製率達61 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P <0.05),榦擾序列FOXO3a 明顯抑製瞭FOXO3a 蛋白的錶達,抑製率達46 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05),聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒榦擾序列對MuRF-1 和FOXO3a 蛋白錶達的抑製率達64 ﹪及42 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05);轉染後72 h,榦擾序列MuRF-1 對MuRF-1 蛋白錶達的抑製率達70 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05),榦擾序列FOXO3a 對FOXO3a 蛋白錶達的抑製率達72 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05),聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒榦擾序列對MuRF-1 和FOXO3a 蛋白錶達的抑製率達73 ﹪及74 ﹪,與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05),與48 h 相比,抑製效應更為明顯,與對mRNA 水平的影響一緻.(4)MuRF-1 的siRNA 重組質粒與聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒榦擾序列MuRF-1 對MuRF-1 的mRNA 和蛋白抑製效果相比差異無統計學意義(P >0.05),FOXO3a 的siRNA 重組質粒與聯閤MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒榦擾序列FOXO3a 對FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑製效果相比差異無統計學意義(P > 0.05).結論 ( 1)RNA 榦擾技術在體外能夠明顯抑製汎素連接酶MuRF-1 和扠頭蛋白轉錄因子FOXO3a 基因的錶達.(2)體外研究中MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒聯閤轉染與各基因siRNA 重組質粒單獨轉染其榦擾序列對MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑製效果無差彆.(3)活體實驗中MuRF-1 與FOXO3a 兩基因siRNA 重組質粒聯閤轉染與各基因siRNA 重組質粒單獨轉染其榦擾序列對MuRF-1 或FOXO3a 的mRNA 和蛋白抑製效果尚不明確,這為RNAi 介導的失神經骨骼肌萎縮基因治療提供瞭一種新的思路.
목적 탐토RNAi 기술체외억제MuRF-1 혹FOXO3a 기인표체적효과,위RNAi 개도적실신경골격기위축기인치료전정기출.방법 체외배양대서성기세포계L6,장MuRF-1 화(혹)FOXO3a siRNA 중조질립재Lipofectamine 2000 개도하전염,우화여검측계통적전염효솔;장2 μg MuRF-1 혹FOXO3a 기인siRNA 중조질립전염L6,전염후48 h여72 h,채용실시정량PCR검측siRNA중조질립대MuRF-1화FOXO3a적mRNA적억제효과,사용Western 인적검측siRNA 중조질립대MuRF-1 화FOXO3a 단백수평적억제효과.용단인소방차분석방법화LSD 법진행조간비교.결과 ( 1)질립전염후24 h,형광현미경하가견세포중유대량명량적록색형광표체,현시계통유교고적전염효솔.(2)실시정량PCR분석결과현시:MuRF-1 여FOXO3a 각자적siRNA 중조질립전염후48 h,이자간우서렬재mRNA 수평분별명현억제료MuRF-1 화FOXO3a 적표체,억제솔체67 ﹪화54 ﹪,여대조조상비차이균유통계학의의(P < 0.05),연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립전염후48 h,간우서렬재mRNA 수평명현억제료MuRF-1 급FOXO3a 적표체,억제솔체61 ﹪급58 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05);전염후72 h,MuRF-1 여FOXO3a각자적siRNA 중조질립간우서렬대MuRF-1 화FOXO3a 적mRNA 적억제솔분별체79 ﹪화81 ﹪,연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립간우서렬대MuRF-1 화FOXO3a 적mRNA적억제솔체77 ﹪급72 ﹪,여대조조상비차이균유통계학의의(P < 0.05),여48 h 상비,억제효응경위명현.(3)Western 인적회도분석결과현시:전염후48 h,간우서렬MuRF-1명현억제료MuRF-1 단백적표체,억제솔체61 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P <0.05),간우서렬FOXO3a 명현억제료FOXO3a 단백적표체,억제솔체46 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05),연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립간우서렬대MuRF-1 화FOXO3a 단백표체적억제솔체64 ﹪급42 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05);전염후72 h,간우서렬MuRF-1 대MuRF-1 단백표체적억제솔체70 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05),간우서렬FOXO3a 대FOXO3a 단백표체적억제솔체72 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05),연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립간우서렬대MuRF-1 화FOXO3a 단백표체적억제솔체73 ﹪급74 ﹪,여대조조상비차이유통계학의의(P < 0.05),여48 h 상비,억제효응경위명현,여대mRNA 수평적영향일치.(4)MuRF-1 적siRNA 중조질립여연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립간우서렬MuRF-1 대MuRF-1 적mRNA 화단백억제효과상비차이무통계학의의(P >0.05),FOXO3a 적siRNA 중조질립여연합MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립간우서렬FOXO3a 대FOXO3a 적mRNA 화단백억제효과상비차이무통계학의의(P > 0.05).결론 ( 1)RNA 간우기술재체외능구명현억제범소련접매MuRF-1 화차두단백전록인자FOXO3a 기인적표체.(2)체외연구중MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립연합전염여각기인siRNA 중조질립단독전염기간우서렬대MuRF-1 혹FOXO3a 적mRNA 화단백억제효과무차별.(3)활체실험중MuRF-1 여FOXO3a 량기인siRNA 중조질립연합전염여각기인siRNA 중조질립단독전염기간우서렬대MuRF-1 혹FOXO3a 적mRNA 화단백억제효과상불명학,저위RNAi 개도적실신경골격기위축기인치료제공료일충신적사로.
