中华细胞与干细胞杂志（电子版）
中華細胞與榦細胞雜誌（電子版）
중화세포여간세포잡지（전자판）
CHINESE JOURNAL OF CELL AND STEM CELL
2013年
2期
78-82
,共5页
朱志祥%梁炳生%冯勇%达志峰%丁洁%韦建%贾英伟
硃誌祥%樑炳生%馮勇%達誌峰%丁潔%韋建%賈英偉
주지상%량병생%풍용%체지봉%정길%위건%가영위
成肌细胞%L6%MuRF-1%质粒转染%RNA%干扰
成肌細胞%L6%MuRF-1%質粒轉染%RNA%榦擾
성기세포%L6%MuRF-1%질립전염%RNA%간우
目的 探讨RNAi 技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1 基因最有效的siRNA 重组质粒.方法 根据大鼠MuRF-1 基因的mRNA 序列,设计4 组干扰序列,即siRNA MuRF1- Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000 转染试剂将siRNA 重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48 h 与72 h,采用实时定量PCR 和Western blot 或免疫印迹检测其对MuRF-1 表达的抑制效果.MuRFl 基因siRNA 重组质粒瞬时转染后mRNA 和蛋白质数据以x ± s 表示.对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析;多个样本均数的两两比较用LSD 检验.结果 ( 1)实时定量PCR 显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1 的mRNA 的抑制率在转染后48 h 分别为67 ﹪、31 ﹪、11 ﹪,20 ﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F = 4.527,P = 0.024);72 h 分别为79 ﹪、59 ﹪、50 ﹪和61 ﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F = 19.088,P < 0.001),与48 h 相比,抑制效应更为明显,但以siRNA MuRF1- Ⅰ的抑制效果最为明显(t = 8.201,P <0.001).(2)使用Western 印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF-1 的蛋白的抑制率在转染后48 h 分别为61 ﹪、40 ﹪、9 ﹪和15 ﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F= 4.286,P = 0.028);72 h 分别为70 ﹪、54 ﹪、30 ﹪和46 ﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F = 3.731,P = 0.042);与48 h 相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异(tⅠ = 3.256,P = 0.009;t Ⅱ = 2.512,P = 0.03),但MuRFl- Ⅲ和MuRFl- Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异(P > 0.05).四对序列中,以siRNA MuRF1- Ⅰ的抑制效果最为明显.蛋白水平的抑制效果与mRNA 水平基本一致.结论 成功筛选出对MuRF-1 基因有效的siRNA 重组质粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,为通过RNAi 技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础.
目的 探討RNAi 技術體外抑製大鼠肌肉環狀指蛋白1(MuRF-1)基因錶達的效果,篩選齣針對MuRF-1 基因最有效的siRNA 重組質粒.方法 根據大鼠MuRF-1 基因的mRNA 序列,設計4 組榦擾序列,即siRNA MuRF1- Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000 轉染試劑將siRNA 重組質粒轉染大鼠成肌細胞繫L6,于轉染後48 h 與72 h,採用實時定量PCR 和Western blot 或免疫印跡檢測其對MuRF-1 錶達的抑製效果.MuRFl 基因siRNA 重組質粒瞬時轉染後mRNA 和蛋白質數據以x ± s 錶示.對照組與四組實驗組的比較用單因素方差分析;多箇樣本均數的兩兩比較用LSD 檢驗.結果 ( 1)實時定量PCR 顯示四組榦擾質粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對基因MuRF-1 的mRNA 的抑製率在轉染後48 h 分彆為67 ﹪、31 ﹪、11 ﹪,20 ﹪,不同榦擾序列的抑製效果有差異(F = 4.527,P = 0.024);72 h 分彆為79 ﹪、59 ﹪、50 ﹪和61 ﹪,不同榦擾序列的抑製效果有差異(F = 19.088,P < 0.001),與48 h 相比,抑製效應更為明顯,但以siRNA MuRF1- Ⅰ的抑製效果最為明顯(t = 8.201,P <0.001).(2)使用Western 印跡灰度分析顯示四組榦擾序列對基因MuRF-1 的蛋白的抑製率在轉染後48 h 分彆為61 ﹪、40 ﹪、9 ﹪和15 ﹪,不同榦擾序列的抑製效果有差異(F= 4.286,P = 0.028);72 h 分彆為70 ﹪、54 ﹪、30 ﹪和46 ﹪,不同榦擾序列的抑製效果有差異(F = 3.731,P = 0.042);與48 h 相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑製效應與對照組相比有顯著性差異(tⅠ = 3.256,P = 0.009;t Ⅱ = 2.512,P = 0.03),但MuRFl- Ⅲ和MuRFl- Ⅳ與對照組相比仍無顯著性差異(P > 0.05).四對序列中,以siRNA MuRF1- Ⅰ的抑製效果最為明顯.蛋白水平的抑製效果與mRNA 水平基本一緻.結論 成功篩選齣對MuRF-1 基因有效的siRNA 重組質粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,為通過RNAi 技術進一步研究其功能以及基因靶嚮治療奠定瞭基礎.
목적 탐토RNAi 기술체외억제대서기육배상지단백1(MuRF-1)기인표체적효과,사선출침대MuRF-1 기인최유효적siRNA 중조질립.방법 근거대서MuRF-1 기인적mRNA 서렬,설계4 조간우서렬,즉siRNA MuRF1- Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,이용lipofactamine2000 전염시제장siRNA 중조질립전염대서성기세포계L6,우전염후48 h 여72 h,채용실시정량PCR 화Western blot 혹면역인적검측기대MuRF-1 표체적억제효과.MuRFl 기인siRNA 중조질립순시전염후mRNA 화단백질수거이x ± s 표시.대조조여사조실험조적비교용단인소방차분석;다개양본균수적량량비교용LSD 검험.결과 ( 1)실시정량PCR 현시사조간우질립MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ대기인MuRF-1 적mRNA 적억제솔재전염후48 h 분별위67 ﹪、31 ﹪、11 ﹪,20 ﹪,불동간우서렬적억제효과유차이(F = 4.527,P = 0.024);72 h 분별위79 ﹪、59 ﹪、50 ﹪화61 ﹪,불동간우서렬적억제효과유차이(F = 19.088,P < 0.001),여48 h 상비,억제효응경위명현,단이siRNA MuRF1- Ⅰ적억제효과최위명현(t = 8.201,P <0.001).(2)사용Western 인적회도분석현시사조간우서렬대기인MuRF-1 적단백적억제솔재전염후48 h 분별위61 ﹪、40 ﹪、9 ﹪화15 ﹪,불동간우서렬적억제효과유차이(F= 4.286,P = 0.028);72 h 분별위70 ﹪、54 ﹪、30 ﹪화46 ﹪,불동간우서렬적억제효과유차이(F = 3.731,P = 0.042);여48 h 상비,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ억제효응여대조조상비유현저성차이(tⅠ = 3.256,P = 0.009;t Ⅱ = 2.512,P = 0.03),단MuRFl- Ⅲ화MuRFl- Ⅳ여대조조상비잉무현저성차이(P > 0.05).사대서렬중,이siRNA MuRF1- Ⅰ적억제효과최위명현.단백수평적억제효과여mRNA 수평기본일치.결론 성공사선출대MuRF-1 기인유효적siRNA 중조질립,즉siRNA MuRF1-Ⅰ,위통과RNAi 기술진일보연구기공능이급기인파향치료전정료기출.
