CAJ | 학술논문

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌.本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列；通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法.优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,T的酶(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50 μL,反应的退火温度为55℃.实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应.2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性.该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础. 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我國海水養殖動物5種重要的病原菌.本研究在分析瞭其緻病因子基因的基礎上,依據擴增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,設計瞭5套特異性的套式PCR引物,併在各內引物的5'耑分彆加上能被一對通用引物識彆的標籤序列；通過對套式PCR中影響擴增結果的引物混閤物濃度、退火溫度、Mg2+濃度、dNTPs濃度以及Taq DNA聚閤酶濃度等5箇反應參數的調整和優化,最終建立瞭一種能同步檢測海水養殖動物5種常見病原菌的Arm-PCR方法.優化後的Arm-PCR方法第一步PCR反應體繫為:10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,T的酶(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA模闆各1μL,滅菌雙蒸餾水補足至50 μL,反應的退火溫度為55℃.實驗結果錶明:對鰻弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌和副溶血弧菌這5種病原菌,使用該方法可以在1支反應管內快速、同步進行檢測,得到大小分彆為144、190、266、315和371 bp的特異性產物,其檢齣靈敏度分彆為1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg細菌基因組DNA;該方法特異性彊,與大腸桿菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等其他細菌以及半滑舌鰨基因組DNA不產生交扠反應.2012年,應用該Arm-PCR方法對分離自病魚的24箇優勢菌株進行瞭檢測,確定齣5株遲緩愛德華氏菌、3株嗜水氣單胞菌、2株哈維氏弧菌及2株副溶血弧菌,證實該方法具有良好的可靠性和實用性.該方法不僅適用于海水養殖動物中緻病性鰻弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌的快速、同步檢測和病原流行情況調查,也為進一步開髮相應的基因芯片檢測方法打下瞭基礎.
만호균(Vibrio anguillarum)、합유씨호균(V.harveyi)、기수기단포균(Aeromonas hydrophila)、지완애덕화씨균(Edwardsiella tarda)화부용혈호균(V.parahaemolyticus)시아국해수양식동물5충중요적병원균.본연구재분석료기치병인자기인적기출상,의거확증자증구다중PCR(Arm-PCR)적원리,설계료5투특이성적투식PCR인물,병재각내인물적5'단분별가상능피일대통용인물식별적표첨서렬；통과대투식PCR중영향확증결과적인물혼합물농도、퇴화온도、Mg2+농도、dNTPs농도이급Taq DNA취합매농도등5개반응삼수적조정화우화,최종건립료일충능동보검측해수양식동물5충상견병원균적Arm-PCR방법.우화후적Arm-PCR방법제일보PCR반응체계위:10×PCR Buffer 5 μL(함20 mmol/L적Mg2+),dNTP(각2.5mmol/L)5μL,T적매(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA모판각1μL,멸균쌍증류수보족지50 μL,반응적퇴화온도위55℃.실험결과표명:대만호균、합유씨호균、기수기단포균、지완애덕화씨균화부용혈호균저5충병원균,사용해방법가이재1지반응관내쾌속、동보진행검측,득도대소분별위144、190、266、315화371 bp적특이성산물,기검출령민도분별위1.745、1.847、16.000、28.126화369.900 pg세균기인조DNA;해방법특이성강,여대장간균(Escherichia coli)、용조호균(V.alginolyticus)、하돈독소가교체단포균(Pseudoalteromonas tetraodonis、고초아포간균(Bacillus subtilis)등기타세균이급반활설탑기인조DNA불산생교차반응.2012년,응용해Arm-PCR방법대분리자병어적24개우세균주진행료검측,학정출5주지완애덕화씨균、3주기수기단포균、2주합유씨호균급2주부용혈호균,증실해방법구유량호적가고성화실용성.해방법불부괄용우해수양식동물중치병성만호균、합유씨호균、기수기단포균、지완애덕화씨균、부용혈호균적쾌속、동보검측화병원류행정황조사,야위진일보개발상응적기인심편검측방법타하료기출.