南方农业学报
南方農業學報
남방농업학보
GUANGXI AGRICULTURAL SCIENCES
2014年
5期
858-863
,共6页
张晓溪%刘庆友%邓彦飞%罗婵%崔奎青%石德顺
張曉溪%劉慶友%鄧彥飛%囉嬋%崔奎青%石德順
장효계%류경우%산언비%라선%최규청%석덕순
水牛%RNA聚合酶Ⅲ启动子%7SK%U6%克隆%鉴定%基因沉默
水牛%RNA聚閤酶Ⅲ啟動子%7SK%U6%剋隆%鑒定%基因沉默
수우%RNA취합매Ⅲ계동자%7SK%U6%극륭%감정%기인침묵
buffalo%RNA polymerase Ⅲ promoter%7SK%U6%cloning%identification%gene silencing
[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P＜0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P＞0.05).[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.
[目的]穫得有效的水牛RNA聚閤酶Ⅲ啟動子序列,為開展水牛源細胞的基因特異沉默研究奠定基礎.[方法]通過啟動子上、下遊保守序列對水牛源啟動子7SK、U6進行剋隆和啟動子關鍵順式作用元件識彆,利用一段針對EGFP的shRNA片段(shEGFP)對水牛7SK、U6啟動子進行功能性分析,然後分彆在水牛源及鼠源細胞中與pEGFP-N1共轉染,轉染48h後用熒光顯微鏡檢測EGFP的錶達情況,併用流式細胞儀和熒光實時定量PCR檢測EGFP沉默錶達情況.[結果]剋隆穫得水牛7SK、U6啟動子序列分彆為430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.連接shEGFP後與pEGFP-N1共轉染細胞,通過熒光顯微鏡可觀察到細胞髮生瞭明顯的熒光錶達沉默現象;通過流式細胞分析,髮現水牛7SK和U6啟動子引導的shEGFP在水牛源細胞中沉默效率高達93.82％和87.45％;熒光實時定量PCR檢測結果顯示,在轉染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF細胞中,EGFP錶達水平均顯著低于其他物種啟動子的細胞轉染組(P＜0.05),而在鼠源PT67細胞中,水牛啟動子的啟動效率與其他物種啟動子差異不顯著(P＞0.05).[結論]水牛7SK和U6啟動子可高效啟動shRNA錶達,且具有一定的物種特異性.
[목적]획득유효적수우RNA취합매Ⅲ계동자서렬,위개전수우원세포적기인특이침묵연구전정기출.[방법]통과계동자상、하유보수서렬대수우원계동자7SK、U6진행극륭화계동자관건순식작용원건식별,이용일단침대EGFP적shRNA편단(shEGFP)대수우7SK、U6계동자진행공능성분석,연후분별재수우원급서원세포중여pEGFP-N1공전염,전염48h후용형광현미경검측EGFP적표체정황,병용류식세포의화형광실시정량PCR검측EGFP침묵표체정황.[결과]극륭획득수우7SK、U6계동자서렬분별위430화357 bp,기OCT-1(혹CACCC합)급TATA합고도보수.련접shEGFP후여pEGFP-N1공전염세포,통과형광현미경가관찰도세포발생료명현적형광표체침묵현상;통과류식세포분석,발현수우7SK화U6계동자인도적shEGFP재수우원세포중침묵효솔고체93.82％화87.45％;형광실시정량PCR검측결과현시,재전염bu7SK-shEGFP화buU6-shEGFP적수우원BFF세포중,EGFP표체수평균현저저우기타물충계동자적세포전염조(P＜0.05),이재서원PT67세포중,수우계동자적계동효솔여기타물충계동자차이불현저(P＞0.05).[결론]수우7SK화U6계동자가고효계동shRNA표체,차구유일정적물충특이성.
