中国中西医结合肾病杂志
中國中西醫結閤腎病雜誌
중국중서의결합신병잡지
CHINESE JOURNAL OF INTEGRATED TRADITIONAL AND WESTERN NEPHROLOGY
2014年
2期
103-106
,共4页
费敏%李平%赵婷婷%孙斯凡%古艳婷%王华%张浩军%杨靖
費敏%李平%趙婷婷%孫斯凡%古豔婷%王華%張浩軍%楊靖
비민%리평%조정정%손사범%고염정%왕화%장호군%양정
EPHX2%重组质粒%NF-κBp65%糖尿病肾病
EPHX2%重組質粒%NF-κBp65%糖尿病腎病
EPHX2%중조질립%NF-κBp65%당뇨병신병
EPHX2%Recombinant plasmids%NF-κBp65%Diabetic nephropathy
目的:构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞(human embryonic kidney 293T,HEK293T)中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响.方法:提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系.Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响.结果:(1)两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变.(2)转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;(3)TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达;(4)EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高(P<0.05).结论:成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒(L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5),可在HEK293T细胞中过表达.为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础.
目的:構建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因過錶達重組質粒,觀察其在人胚腎細胞(human embryonic kidney 293T,HEK293T)中的錶達,及對HEK293T細胞NF-κBp65 mRNA錶達的影響.方法:提取LETO、OLETF大鼠腎髒組織總RNA,RT-PCR方法擴增編碼EPHX2基因的cDNA,剋隆至T-載體併測序,經亞剋隆至真覈錶達載體pcDNA3.1/V5-His,構建兩型大鼠EPHX2過錶達重組質粒,酶切鑒定併測序,採用燐痠鈣共沉澱法轉染HEK293T細胞繫.Western Blot方法檢測EPHX2融閤蛋白的錶達,RT-PCR方法檢測EPHX2基因過錶達對HEK293T細胞NF-κBp65錶達水平的影響.結果:(1)兩箇重組質粒均含有完整EPHX2 cDNA,測序證實OLETF型大鼠較LETO型大鼠EPHX2重組質粒有五箇覈苷痠位點的改變.(2)轉染HEK293T細胞後,Western Blot證實融閤蛋白成功錶達;(3)TNF-α刺激增加HEK293T細胞中NF-κBp65 mRNA錶達;(4)EPHX2基因過錶達促進TNF-α刺激後的HEK293T細胞中NF-κBp65 mRNA錶達升高(P<0.05).結論:成功構建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2過錶達重組質粒(L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5),可在HEK293T細胞中過錶達.為進一步探討EPHX2基因在糖尿病腎病髮生髮展中的作用奠定瞭基礎.
목적:구건LETO、OLETF대서EPHX2기인과표체중조질립,관찰기재인배신세포(human embryonic kidney 293T,HEK293T)중적표체,급대HEK293T세포NF-κBp65 mRNA표체적영향.방법:제취LETO、OLETF대서신장조직총RNA,RT-PCR방법확증편마EPHX2기인적cDNA,극륭지T-재체병측서,경아극륭지진핵표체재체pcDNA3.1/V5-His,구건량형대서EPHX2과표체중조질립,매절감정병측서,채용린산개공침정법전염HEK293T세포계.Western Blot방법검측EPHX2융합단백적표체,RT-PCR방법검측EPHX2기인과표체대HEK293T세포NF-κBp65표체수평적영향.결과:(1)량개중조질립균함유완정EPHX2 cDNA,측서증실OLETF형대서교LETO형대서EPHX2중조질립유오개핵감산위점적개변.(2)전염HEK293T세포후,Western Blot증실융합단백성공표체;(3)TNF-α자격증가HEK293T세포중NF-κBp65 mRNA표체;(4)EPHX2기인과표체촉진TNF-α자격후적HEK293T세포중NF-κBp65 mRNA표체승고(P<0.05).결론:성공구건LETO형급OLETF형대서EPHX2과표체중조질립(L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5),가재HEK293T세포중과표체.위진일보탐토EPHX2기인재당뇨병신병발생발전중적작용전정료기출.
