烟草科技
煙草科技
연초과기
TOBACCO SCIENCE & TECHNOLOGY
2014年
7期
69-74,84
,共7页
钟晓武%付强%邹颉%赵杰宏%林世锋%郭玉双%任学良
鐘曉武%付彊%鄒頡%趙傑宏%林世鋒%郭玉雙%任學良
종효무%부강%추힐%조걸굉%림세봉%곽옥쌍%임학량
烟草%糖基转移酶%基因%蛋白酶
煙草%糖基轉移酶%基因%蛋白酶
연초%당기전이매%기인%단백매
Nicotiana tabacum%Glucosyltransferase%Gene%Protease
为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段.序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41.通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15℃下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白.重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在.将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白.
為揭示煙草糖基轉移酶的活性及生物學功能,從煙草栽培品種中剋隆瞭煙草糖基轉移酶基因NtGT5a,基于GenBank的煙草糖基轉移酶基因NtGT5a的覈苷痠序列(GenBank登錄號AB176523),設計併閤成特異性引物,以紅花大金元葉片總RNA為模闆,通過RT-PCR方法穫得瞭煙草糖基轉移酶基因NtGT5a的cDNA片段.序列分析錶明,該基因編碼區為1458 bp,編碼485箇氨基痠殘基,推測的蛋白分子量為54.21 kDa,理論等電點為5.41.通過構建重組錶達載體pCold-SUMO-NtGT5a,併轉化大腸桿菌BL21(DE3),在15℃下經0.2 mmol/L IPTG誘導22 h錶達產生瞭SUMO-NtGT5a重組蛋白.重組蛋白部分以包涵體形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在.將重組蛋白的可溶性組分經過Ni-NTA柱層析純化和凝膠過濾層析,用SUMO蛋白酶切除SUMO標籤,再用鎳柱純化穫得瞭高純度的NtGT5重組蛋白.
위게시연초당기전이매적활성급생물학공능,종연초재배품충중극륭료연초당기전이매기인NtGT5a,기우GenBank적연초당기전이매기인NtGT5a적핵감산서렬(GenBank등록호AB176523),설계병합성특이성인물,이홍화대금원협편총RNA위모판,통과RT-PCR방법획득료연초당기전이매기인NtGT5a적cDNA편단.서렬분석표명,해기인편마구위1458 bp,편마485개안기산잔기,추측적단백분자량위54.21 kDa,이론등전점위5.41.통과구건중조표체재체pCold-SUMO-NtGT5a,병전화대장간균BL21(DE3),재15℃하경0.2 mmol/L IPTG유도22 h표체산생료SUMO-NtGT5a중조단백.중조단백부분이포함체형식존재,부분이가용성단백형식존재.장중조단백적가용성조분경과Ni-NTA주층석순화화응효과려층석,용SUMO단백매절제SUMO표첨,재용얼주순화획득료고순도적NtGT5중조단백.
