浙江工业大学学报
浙江工業大學學報
절강공업대학학보
Journal of Zhejiang University of Technology
2014年
1期
50-53
,共4页
水蛭素%分泌表达%突变体%活性测定
水蛭素%分泌錶達%突變體%活性測定
수질소%분비표체%돌변체%활성측정
hirudin%secretory expression%mutant%activity determination
水蛭素(Hirudin,HV)是目前已知的最强有力的凝血酶天然抑制剂,对多种血栓性疾病有很好的预防和治疗作用.构建两种融合DsbA信号肽的分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌,一种分泌的是N端第一个氨基酸突变为Ala的突变型水蛭素Ⅱ(spHV2mut),而另一种分泌的是天然型水蛭素Ⅱ(spHV2).采用重叠延伸(SOE)技术对水蛭素ⅡN端第一个氨基酸的基因序列进行定点突变,分别将突变和未突变的水蛭素Ⅱ基因重组至DsbA信号肽的编码基因下游,经限制性内切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后,重组于表达载体pET-39b(+),转化至E.coli BL21 (DE3),获得两种工程菌.分别经IPTG诱导表达和周质蛋白提取,再经阴离子交换层析纯化,得到两种重组水蛭素.通过凝血酶滴定法进行活性测定,比活性相同,突变型的表达量提高了近一倍,天然型水蛭素Ⅱ(spHV2)为500 ATU/mL,突变型水蛭素Ⅱ(spHV2mut)为900 ATU/mL.
水蛭素(Hirudin,HV)是目前已知的最彊有力的凝血酶天然抑製劑,對多種血栓性疾病有很好的預防和治療作用.構建兩種融閤DsbA信號肽的分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌,一種分泌的是N耑第一箇氨基痠突變為Ala的突變型水蛭素Ⅱ(spHV2mut),而另一種分泌的是天然型水蛭素Ⅱ(spHV2).採用重疊延伸(SOE)技術對水蛭素ⅡN耑第一箇氨基痠的基因序列進行定點突變,分彆將突變和未突變的水蛭素Ⅱ基因重組至DsbA信號肽的編碼基因下遊,經限製性內切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切後,重組于錶達載體pET-39b(+),轉化至E.coli BL21 (DE3),穫得兩種工程菌.分彆經IPTG誘導錶達和週質蛋白提取,再經陰離子交換層析純化,得到兩種重組水蛭素.通過凝血酶滴定法進行活性測定,比活性相同,突變型的錶達量提高瞭近一倍,天然型水蛭素Ⅱ(spHV2)為500 ATU/mL,突變型水蛭素Ⅱ(spHV2mut)為900 ATU/mL.
수질소(Hirudin,HV)시목전이지적최강유력적응혈매천연억제제,대다충혈전성질병유흔호적예방화치료작용.구건량충융합DsbA신호태적분비형수질소Ⅱ기인공정균,일충분비적시N단제일개안기산돌변위Ala적돌변형수질소Ⅱ(spHV2mut),이령일충분비적시천연형수질소Ⅱ(spHV2).채용중첩연신(SOE)기술대수질소ⅡN단제일개안기산적기인서렬진행정점돌변,분별장돌변화미돌변적수질소Ⅱ기인중조지DsbA신호태적편마기인하유,경한제성내절매Nde Ⅰ화BamH Ⅰ매절후,중조우표체재체pET-39b(+),전화지E.coli BL21 (DE3),획득량충공정균.분별경IPTG유도표체화주질단백제취,재경음리자교환층석순화,득도량충중조수질소.통과응혈매적정법진행활성측정,비활성상동,돌변형적표체량제고료근일배,천연형수질소Ⅱ(spHV2)위500 ATU/mL,돌변형수질소Ⅱ(spHV2mut)위900 ATU/mL.
