医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2014年
1期
12-16
,共5页
Akt3%重组腺病毒表达载体%基因表达%BT474细胞%四唑盐比色测定
Akt3%重組腺病毒錶達載體%基因錶達%BT474細胞%四唑鹽比色測定
Akt3%중조선병독표체재체%기인표체%BT474세포%사서염비색측정
目的 构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体,探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响.方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3 cDNA,以XhoⅠ及BglⅡ酶切位点克隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,测序鉴定后与骨架载体PAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,获得重组腺病毒表达载体pAd-AKT3后,转染293A细胞,进行病毒的包装.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,Western印迹方法分析细胞内AKT3蛋白质的表达.通过MTT实验,研究AKT3过表达前后BT474乳腺导管癌细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.重组腺病毒效价为2.6×108 pfu /ml,重组腺病毒转导后,BT474乳腺导管癌细胞中可检测到AKT3的过表达:Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在BT474细胞中表达良好,而转导空载体腺病毒及未转导细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的重组腺病毒组,其增殖活性显著高于转导空载体腺病毒组及未转导细胞组,差异具有统计学意义(P﹤0.01),而后两者差异无统计学意义(P﹥0.05).结论 成功地构建了AKT3重组腺病毒表达载体,AKT3过表达可增强BT474乳腺导管癌的增殖,为进一步研究AKT3的功能奠定了基础.
目的 構建人AKT3基因的重組腺病毒錶達載體,探究其對人乳腺導管癌細胞增殖的影響.方法應用RT-PCR方法從流產胎兒腦組織總RNA中擴增齣AKT3 cDNA,以XhoⅠ及BglⅡ酶切位點剋隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭載體,測序鑒定後與骨架載體PAdeasy-1在BJ5183細菌中進行同源重組,穫得重組腺病毒錶達載體pAd-AKT3後,轉染293A細胞,進行病毒的包裝.熒光顯微鏡下觀察細胞內綠色熒光,測定病毒效價,Western印跡方法分析細胞內AKT3蛋白質的錶達.通過MTT實驗,研究AKT3過錶達前後BT474乳腺導管癌細胞增殖的變化.結果 重組載體經酶切鑒定和測序證實目的 基因正確無誤.重組腺病毒效價為2.6×108 pfu /ml,重組腺病毒轉導後,BT474乳腺導管癌細胞中可檢測到AKT3的過錶達:Western印跡檢測結果顯示AKT3融閤蛋白在BT474細胞中錶達良好,而轉導空載體腺病毒及未轉導細胞對照中未見有此融閤蛋白質條帶;MTT結果顯示AKT3錶達上調的重組腺病毒組,其增殖活性顯著高于轉導空載體腺病毒組及未轉導細胞組,差異具有統計學意義(P﹤0.01),而後兩者差異無統計學意義(P﹥0.05).結論 成功地構建瞭AKT3重組腺病毒錶達載體,AKT3過錶達可增彊BT474乳腺導管癌的增殖,為進一步研究AKT3的功能奠定瞭基礎.
목적 구건인AKT3기인적중조선병독표체재체,탐구기대인유선도관암세포증식적영향.방법응용RT-PCR방법종유산태인뇌조직총RNA중확증출AKT3 cDNA,이XhoⅠ급BglⅡ매절위점극륭입선병독pShuttle-IRES-hrGFP-1천사재체,측서감정후여골가재체PAdeasy-1재BJ5183세균중진행동원중조,획득중조선병독표체재체pAd-AKT3후,전염293A세포,진행병독적포장.형광현미경하관찰세포내록색형광,측정병독효개,Western인적방법분석세포내AKT3단백질적표체.통과MTT실험,연구AKT3과표체전후BT474유선도관암세포증식적변화.결과 중조재체경매절감정화측서증실목적 기인정학무오.중조선병독효개위2.6×108 pfu /ml,중조선병독전도후,BT474유선도관암세포중가검측도AKT3적과표체:Western인적검측결과현시AKT3융합단백재BT474세포중표체량호,이전도공재체선병독급미전도세포대조중미견유차융합단백질조대;MTT결과현시AKT3표체상조적중조선병독조,기증식활성현저고우전도공재체선병독조급미전도세포조,차이구유통계학의의(P﹤0.01),이후량자차이무통계학의의(P﹥0.05).결론 성공지구건료AKT3중조선병독표체재체,AKT3과표체가증강BT474유선도관암적증식,위진일보연구AKT3적공능전정료기출.
