医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2014年
1期
7-11,16
,共6页
付雪%高星杰%张毅%史雪彬%辛灵彪%刘欣%于林%杨洁%何津岩
付雪%高星傑%張毅%史雪彬%辛靈彪%劉訢%于林%楊潔%何津巖
부설%고성걸%장의%사설빈%신령표%류흔%우림%양길%하진암
IGFBP2%3'UTR%GFP-MS2%重组质粒%应激颗粒
IGFBP2%3'UTR%GFP-MS2%重組質粒%應激顆粒
IGFBP2%3'UTR%GFP-MS2%중조질립%응격과립
目的 利用GFP-MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)进行绿色荧光标记,构建pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2重组质粒.方法 提取HeLa细胞总RNA,以针对IGFBP2-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带有EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的IGFBP2-3′UTR目的 基因,再利用双酶切法将目的 片段连接到pSG5载体(启动子为T7)上,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR;同时,以BglⅡ和BamHⅠ双酶切法从pCR4-24×MS2SL-stable质粒上切下24×MS2结合位点片段并将其插入pT7-IGFBP2-3′UTR,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2;然后将构建的重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2、pMS2-GFP质粒与pERFP-Tudor-SN质粒共同转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜检测IGFBP2-3′UTR的荧光标记情况及应激共定位.结果 以酶切质粒法及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,激光共聚焦结果显示在胞浆中检测到IGFBP2-3′UTR的绿色荧光信号,在细胞受到氧化应激时IGFBP2-3′UTR信号呈颗粒状聚集,且与应激颗粒(stress granules,SGs)的标志蛋白Tudor-SN呈共定位关系.结论 针对IGFBP2-3′UTR的GFP-MS2荧光标记系统质粒构建成功;细胞应激时,IGFBP2-3′UTR被招募至SGs结构中.
目的 利用GFP-MS2繫統在活細胞內對胰島素樣生長因子結閤蛋白2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′非翻譯區(3′ untranslated region,3′UTR)進行綠色熒光標記,構建pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2重組質粒.方法 提取HeLa細胞總RNA,以針對IGFBP2-3′非翻譯區的特異性片段為反轉錄引物,反轉錄齣cDNA,併以其為模闆,降落PCR法擴增齣帶有EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切位點的IGFBP2-3′UTR目的 基因,再利用雙酶切法將目的 片段連接到pSG5載體(啟動子為T7)上,構建重組質粒pT7-IGFBP2-3′UTR;同時,以BglⅡ和BamHⅠ雙酶切法從pCR4-24×MS2SL-stable質粒上切下24×MS2結閤位點片段併將其插入pT7-IGFBP2-3′UTR,構建重組質粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2;然後將構建的重組質粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2、pMS2-GFP質粒與pERFP-Tudor-SN質粒共同轉染入HeLa細胞內,以激光共聚焦熒光顯微鏡檢測IGFBP2-3′UTR的熒光標記情況及應激共定位.結果 以酶切質粒法及基因測序法鑒定構建的重組質粒均無誤,激光共聚焦結果顯示在胞漿中檢測到IGFBP2-3′UTR的綠色熒光信號,在細胞受到氧化應激時IGFBP2-3′UTR信號呈顆粒狀聚集,且與應激顆粒(stress granules,SGs)的標誌蛋白Tudor-SN呈共定位關繫.結論 針對IGFBP2-3′UTR的GFP-MS2熒光標記繫統質粒構建成功;細胞應激時,IGFBP2-3′UTR被招募至SGs結構中.
목적 이용GFP-MS2계통재활세포내대이도소양생장인자결합단백2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′비번역구(3′ untranslated region,3′UTR)진행록색형광표기,구건pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2중조질립.방법 제취HeLa세포총RNA,이침대IGFBP2-3′비번역구적특이성편단위반전록인물,반전록출cDNA,병이기위모판,강락PCR법확증출대유EcoRⅠ화BamHⅠ쌍매절위점적IGFBP2-3′UTR목적 기인,재이용쌍매절법장목적 편단련접도pSG5재체(계동자위T7)상,구건중조질립pT7-IGFBP2-3′UTR;동시,이BglⅡ화BamHⅠ쌍매절법종pCR4-24×MS2SL-stable질립상절하24×MS2결합위점편단병장기삽입pT7-IGFBP2-3′UTR,구건중조질립pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2;연후장구건적중조질립pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2、pMS2-GFP질립여pERFP-Tudor-SN질립공동전염입HeLa세포내,이격광공취초형광현미경검측IGFBP2-3′UTR적형광표기정황급응격공정위.결과 이매절질립법급기인측서법감정구건적중조질립균무오,격광공취초결과현시재포장중검측도IGFBP2-3′UTR적록색형광신호,재세포수도양화응격시IGFBP2-3′UTR신호정과립상취집,차여응격과립(stress granules,SGs)적표지단백Tudor-SN정공정위관계.결론 침대IGFBP2-3′UTR적GFP-MS2형광표기계통질립구건성공;세포응격시,IGFBP2-3′UTR피초모지SGs결구중.
