基础医学与临床
基礎醫學與臨床
기출의학여림상
BASIC MEDICAL SCIENCES AND CLINICS
2014年
1期
22-28
,共7页
周建武%何昀%龚梦嘉%毕杨
週建武%何昀%龔夢嘉%畢楊
주건무%하윤%공몽가%필양
维甲酸核受体γ%腺病毒载体%小干扰RNA%肝细胞分化
維甲痠覈受體γ%腺病毒載體%小榦擾RNA%肝細胞分化
유갑산핵수체γ%선병독재체%소간우RNA%간세포분화
retinoic acid receptor-γ%adenovirus vector%small interfering RNA%hepatic differentiation
目的 构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响.方法 设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ.腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1 μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态.结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致.腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60％.其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P＜0.05).ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P＜0.05).结论 成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化.
目的 構建併篩選小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒載體,併探討抑製RARγ錶達對小鼠肝髒祖細胞分化的影響.方法 設計3對特異性針對小鼠RARγ基因的siRNA序列,體外退火形成雙鏈,與SfiⅠ酶切後的pSES-HUS質粒連接,隨後在BJ5183中與pAdEasy-1骨架質粒同源重組穫得pAd-siRARγ重組腺病毒質粒,併在HEK293細胞中包裝腺病毒Ad-siRARγ.腺病毒感染小鼠肝髒祖細胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot檢測RARγ的錶達,1 μmol/L ATRA誘導肝細胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色檢測肝髒細胞分化的狀態.結果 PCR、酶切鑒定均證實siRNA正確剋隆至腺病毒質粒中,測序結果與設計的siRNA序列一緻.腺病毒在HEK293細胞中包裝10 d可見紅色熒光細胞的雲霧狀擴增,HP14.5d細胞的48 h腺病毒感染率為60％.其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑製小鼠HP14.5d細胞中RARγ的錶達(P＜0.05).ATRA可誘導肝細胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色暘性細胞明顯高于對照組,Ad-siRARγ2,3可顯著抑製ATRA誘導的小鼠HP14.5d細胞的ALB錶達和糖原閤成能力(P＜0.05).結論 成功構建併篩選齣能有效抑製RARγ錶達的siRNA腺病毒,感染小鼠肝髒祖細胞HP14.5d能顯著抑製ATRA誘導的肝細胞成熟分化.
목적 구건병사선소서RARγ기인적siRNA선병독재체,병탐토억제RARγ표체대소서간장조세포분화적영향.방법 설계3대특이성침대소서RARγ기인적siRNA서렬,체외퇴화형성쌍련,여SfiⅠ매절후적pSES-HUS질립련접,수후재BJ5183중여pAdEasy-1골가질립동원중조획득pAd-siRARγ중조선병독질립,병재HEK293세포중포장선병독Ad-siRARγ.선병독감염소서간장조세포HP14.5d,real-time PCR급Western blot검측RARγ적표체,1 μmol/L ATRA유도간세포분화,ALB-Gluc활성급PAS염색검측간장세포분화적상태.결과 PCR、매절감정균증실siRNA정학극륭지선병독질립중,측서결과여설계적siRNA서렬일치.선병독재HEK293세포중포장10 d가견홍색형광세포적운무상확증,HP14.5d세포적48 h선병독감염솔위60％.기중,Ad-siRARγ2、3가유효억제소서HP14.5d세포중RARγ적표체(P＜0.05).ATRA가유도간세포분화,ALB-Gluc활성급PAS염색양성세포명현고우대조조,Ad-siRARγ2,3가현저억제ATRA유도적소서HP14.5d세포적ALB표체화당원합성능력(P＜0.05).결론 성공구건병사선출능유효억제RARγ표체적siRNA선병독,감염소서간장조세포HP14.5d능현저억제ATRA유도적간세포성숙분화.
