食品与药品
食品與藥品
식품여약품
FOOD AND DRUG
2013年
6期
381-384
,共4页
刘霞%刘飞%刘少英%朱希强%凌沛学
劉霞%劉飛%劉少英%硃希彊%凌沛學
류하%류비%류소영%주희강%릉패학
CHO细胞%真核表达载体%重组人凝血酶%稳定表达%转染
CHO細胞%真覈錶達載體%重組人凝血酶%穩定錶達%轉染
CHO세포%진핵표체재체%중조인응혈매%은정표체%전염
CHO cells%eukaryotic expression vector%recombinant human thrombin%stable expression%transfection
目的 构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株.方法 利用限制性内切酶EcoR I和XbaI将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1 (+)/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定.采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养.采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定.结果 重组质粒pcDNA3.1 (+)/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量(Mr)为43000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 (+)/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础.
目的 構建含重組人凝血酶基因的重組真覈錶達載體,併轉染哺乳動物細胞CHO,建立穩定錶達重組人凝血酶的細胞株.方法 利用限製性內切酶EcoR I和XbaI將凝血酶基因插入真覈錶達載體pcDNA3.1(+)中,構建含人凝血酶基因的重組質粒pcDNA3.1 (+)/thrombin,利用雙酶切和測序法鑒定.採用暘離子脂質體介導方法,將構建的錶達載體轉染到CHO細胞中,通過G418加壓篩選齣暘性細胞剋隆,建立穩定錶達人凝血酶的細胞株,併擴大培養.採用RT-PCR和SDS-PAGE法檢測其mRNA和蛋白質的錶達,併對其生物活性進行鑒定.結果 重組質粒pcDNA3.1 (+)/thrombin經雙酶切和測序鑒定證實插入序列準確無誤;經RT-PCR和SDS-PAGE法鑒定,轉染的CHO細胞可錶達、分泌人凝血酶,得到的重組人凝血酶錶觀相對分子質量(Mr)為43000左右,與預測一緻,且具有降解併凝固牛纖維蛋白原的活性,其比活為234.1 U/mg.結論 成功構建瞭真覈錶達載體pcDNA3.1 (+)/thrombin,併成功地在CHO細胞中錶達瞭具有生物活性的重組人凝血酶,該體繫的建立為進一步規模化生產重組人凝血酶奠定瞭基礎.
목적 구건함중조인응혈매기인적중조진핵표체재체,병전염포유동물세포CHO,건립은정표체중조인응혈매적세포주.방법 이용한제성내절매EcoR I화XbaI장응혈매기인삽입진핵표체재체pcDNA3.1(+)중,구건함인응혈매기인적중조질립pcDNA3.1 (+)/thrombin,이용쌍매절화측서법감정.채용양리자지질체개도방법,장구건적표체재체전염도CHO세포중,통과G418가압사선출양성세포극륭,건립은정표체인응혈매적세포주,병확대배양.채용RT-PCR화SDS-PAGE법검측기mRNA화단백질적표체,병대기생물활성진행감정.결과 중조질립pcDNA3.1 (+)/thrombin경쌍매절화측서감정증실삽입서렬준학무오;경RT-PCR화SDS-PAGE법감정,전염적CHO세포가표체、분비인응혈매,득도적중조인응혈매표관상대분자질량(Mr)위43000좌우,여예측일치,차구유강해병응고우섬유단백원적활성,기비활위234.1 U/mg.결론 성공구건료진핵표체재체pcDNA3.1 (+)/thrombin,병성공지재CHO세포중표체료구유생물활성적중조인응혈매,해체계적건립위진일보규모화생산중조인응혈매전정료기출.
