解放军医学院学报
解放軍醫學院學報
해방군의학원학보
Academic Journal of Chinese Pla Medical School
2014年
2期
166-169,177
,共5页
李永明%吕刚%范仲凯%曹阳%王岩松%庄培袁%张玉强%李刚
李永明%呂剛%範仲凱%曹暘%王巖鬆%莊培袁%張玉彊%李剛
리영명%려강%범중개%조양%왕암송%장배원%장옥강%리강
低氧诱导因子-lα%增强型绿色荧光蛋白%腺病毒载体%基因重组
低氧誘導因子-lα%增彊型綠色熒光蛋白%腺病毒載體%基因重組
저양유도인자-lα%증강형록색형광단백%선병독재체%기인중조
HIF-1α%enhanced green fluorescent protein%gene recombination
目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用.方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增目的基因HIF-1 α并亚克隆到含有报告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒.将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后进行PCR鉴定并测定病毒滴度.结果 pShuttle-EGFP-HIF-1α经KpnI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb和5.1 kb处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1kb处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒与pAdeno载体重组后,经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒成功包装纯化后经PCR鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1 α基因;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010 PUF/ml.结论 成功构建了HIF-lα和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础.
目的 構建pAdeno-EGFP-HIF-1 α重組腺病毒載體,探討其在脊髓損傷中的作用.方法 採用聚閤酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)法擴增目的基因HIF-1 α併亞剋隆到含有報告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭載體中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1 α重組穿梭質粒.將已構建的重組穿梭質粒轉移至pAdeno骨架載體上,穫得pAdeno-EGFP-HIF-1 α重組腺病毒質粒,繼而在H293細胞中擴增,純化後進行PCR鑒定併測定病毒滴度.結果 pShuttle-EGFP-HIF-1α經KpnI/BamHI雙酶切後瓊脂糖凝膠電泳可見暘性剋隆組在2.5 kb和5.1 kb處齣現兩條帶,而陰性剋隆組隻有5.1kb處一條帶,證明pShuttle-EGFP-HIF-1 α重組穿梭質粒構建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1 α重組穿梭質粒與pAdeno載體重組後,經XhoI單酶切後瓊脂糖凝膠電泳可見暘性剋隆組齣現14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八條帶,而陰性剋隆的腺病毒空載組有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六條帶,證明重組pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒質粒構建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1 α重組腺病毒成功包裝純化後經PCR鑒定,實驗組和暘性對照組中均擴增到2.5 kb片段,證明目的病毒中成功整閤瞭HIF-1 α基因;TCID50法測定純化後的病毒滴度為2×1010 PUF/ml.結論 成功構建瞭HIF-lα和EGFP雙基因共錶達重組腺病毒載體,為進一步研究其在脊髓損傷中的作用奠定瞭基礎.
목적 구건pAdeno-EGFP-HIF-1 α중조선병독재체,탐토기재척수손상중적작용.방법 채용취합매련반응(polymerase chain reaction,PCR)법확증목적기인HIF-1 α병아극륭도함유보고기인EGFP적pShuttle-CMV-EGFP천사재체중,득도pShuttle-EGFP-HIF-1 α중조천사질립.장이구건적중조천사질립전이지pAdeno골가재체상,획득pAdeno-EGFP-HIF-1 α중조선병독질립,계이재H293세포중확증,순화후진행PCR감정병측정병독적도.결과 pShuttle-EGFP-HIF-1α경KpnI/BamHI쌍매절후경지당응효전영가견양성극륭조재2.5 kb화5.1 kb처출현량조대,이음성극륭조지유5.1kb처일조대,증명pShuttle-EGFP-HIF-1 α중조천사질립구건성공;pShuttle-EGFP-HIF-1 α중조천사질립여pAdeno재체중조후,경XhoI단매절후경지당응효전영가견양성극륭조출현14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb팔조대,이음성극륭적선병독공재조유14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb륙조대,증명중조pAdeno-EGFP-HIF1α선병독질립구건성공;pAdeno-EGFP-HIF-1 α중조선병독성공포장순화후경PCR감정,실험조화양성대조조중균확증도2.5 kb편단,증명목적병독중성공정합료HIF-1 α기인;TCID50법측정순화후적병독적도위2×1010 PUF/ml.결론 성공구건료HIF-lα화EGFP쌍기인공표체중조선병독재체,위진일보연구기재척수손상중적작용전정료기출.
