宁夏医科大学学报
寧夏醫科大學學報
저하의과대학학보
JOURNAL OF NINGXIA MEDICAL COLLEGE
2014年
6期
620-624,634,封4
,共7页
贾中发%马琳%和祯泉%周瑜%孙涛%崔建奇
賈中髮%馬琳%和禎泉%週瑜%孫濤%崔建奇
가중발%마림%화정천%주유%손도%최건기
Purα%慢病毒表达载体%RNA沉寂%基因过表达%基因操作
Purα%慢病毒錶達載體%RNA沉寂%基因過錶達%基因操作
Purα%만병독표체재체%RNA침적%기인과표체%기인조작
Puroα%lentivirus vector%RNA silencing%overexpression%gene manipulation
目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1)过表达载体的构建:本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2)ShRNA慢病毒表达载体的构建:根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3)慢病毒包装和滴度测定:将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.
目的 構建Purα基因過錶達以及SiRNA慢病毒錶達載體,通過包裝病毒,以用于神經繫統細胞感染及原代培養神經元的基因操作.方法 1)過錶達載體的構建:本實驗使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體,PCR擴增Purα全長基因,然後亞剋隆到pCDH載體相應的多剋隆位點之中,進行酶切和測序鑒定;2)ShRNA慢病毒錶達載體的構建:根據shRNA的特徵,設計shR-NA的DNA序列以及其反嚮互補序列,然後閤成併剋隆到慢病毒載體pLKO.1-puro的相應位點中.3)慢病毒包裝和滴度測定:將剋隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA載體和病毒包裝質粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相應的比例轉染到293FT細胞中,48h後收集上清液,純化、濃縮,進行滴度測定.結果 測序結果證實所插入片段相位正確,轉染後通過RT-PCR和Western blot證實過錶達組Purα基因錶達增高,而沉寂組的Purα錶達抑製,達到實驗設計要求,可以用于實驗研究.結論 利用本方法可以快速地進行目的基因的基因操作,省時、節約,與同類型的方法比較,具有較大的優越性,可以在實驗中推廣應用.
목적 구건Purα기인과표체이급SiRNA만병독표체재체,통과포장병독,이용우신경계통세포감염급원대배양신경원적기인조작.방법 1)과표체재체적구건:본실험사용pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP화pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP만병독재체,PCR확증Purα전장기인,연후아극륭도pCDH재체상응적다극륭위점지중,진행매절화측서감정;2)ShRNA만병독표체재체적구건:근거shRNA적특정,설계shR-NA적DNA서렬이급기반향호보서렬,연후합성병극륭도만병독재체pLKO.1-puro적상응위점중.3)만병독포장화적도측정:장극륭호적pCDH-Purα화pLKO.1-puro-shRNA재체화병독포장질립pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr안상응적비례전염도293FT세포중,48h후수집상청액,순화、농축,진행적도측정.결과 측서결과증실소삽입편단상위정학,전염후통과RT-PCR화Western blot증실과표체조Purα기인표체증고,이침적조적Purα표체억제,체도실험설계요구,가이용우실험연구.결론 이용본방법가이쾌속지진행목적기인적기인조작,성시、절약,여동류형적방법비교,구유교대적우월성,가이재실험중추엄응용.
