临床肾脏病杂志
臨床腎髒病雜誌
림상신장병잡지
JOURNAL OF CLINICAL NEPHROLOGY
2014年
6期
369-373
,共5页
魏冬月%卢思广%刘健胜%苗莉
魏鼕月%盧思廣%劉健勝%苗莉
위동월%로사엄%류건성%묘리
足细胞%基因%真核表达
足細胞%基因%真覈錶達
족세포%기인%진핵표체
Podocyte%Gene%Recombinant expression
目的 构建重组人Orai1基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株(MPC5)中的表达.方法 根据GcnBank数据库检索到的人Orai1基因序列,人工合成法合成Orai1基因编码区(coding scqucnce,CDS)全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PG-CMV-Orai1,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Wcstcrn blot法分别检测Orai1 基因的转录与翻译.结果 PCR扩增的片段长度为906 bp,双酶切出现两条带,其中约906 bp处可见目的条带.核酸测序结果与GcnBank中所报道的人Orai1基因的CDS序列完全一致.转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光.RT-PCR及Wcstcrn blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orai1均有所增强.结论 成功构建了重组人Orai1基因真核表达载体PG-CMV-Orai1,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2+通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础.
目的 構建重組人Orai1基因真覈錶達載體,觀察其在小鼠腎小毬足細胞株(MPC5)中的錶達.方法 根據GcnBank數據庫檢索到的人Orai1基因序列,人工閤成法閤成Orai1基因編碼區(coding scqucnce,CDS)全長序列,剋隆至質粒錶達載體PG-CMV-IRES-EGFP,構建重組質粒載體PG-CMV-Orai1,通過PCR、雙酶切及基因測序等方法進行鑒定;以脂質體轉染法將重組質粒轉染至MPC5細胞,應用熒光顯微鏡觀察綠色熒光檢測轉染效率,RT-PCR、Wcstcrn blot法分彆檢測Orai1 基因的轉錄與翻譯.結果 PCR擴增的片段長度為906 bp,雙酶切齣現兩條帶,其中約906 bp處可見目的條帶.覈痠測序結果與GcnBank中所報道的人Orai1基因的CDS序列完全一緻.轉染後48h置熒光顯微鏡下觀察,85％以上的足細胞中可見綠色熒光.RT-PCR及Wcstcrn blot實驗結果分彆顯示轉染後的MPC5細胞在mRNA與蛋白水平錶達Orai1均有所增彊.結論 成功構建瞭重組人Orai1基因真覈錶達載體PG-CMV-Orai1,併建立瞭過錶達Orail基因的腎小毬足細胞模型,為深入研究鈣庫操縱的Ca2+通道與足細胞病之間的關繫奠定瞭良好的實驗基礎.
목적 구건중조인Orai1기인진핵표체재체,관찰기재소서신소구족세포주(MPC5)중적표체.방법 근거GcnBank수거고검색도적인Orai1기인서렬,인공합성법합성Orai1기인편마구(coding scqucnce,CDS)전장서렬,극륭지질립표체재체PG-CMV-IRES-EGFP,구건중조질립재체PG-CMV-Orai1,통과PCR、쌍매절급기인측서등방법진행감정;이지질체전염법장중조질립전염지MPC5세포,응용형광현미경관찰록색형광검측전염효솔,RT-PCR、Wcstcrn blot법분별검측Orai1 기인적전록여번역.결과 PCR확증적편단장도위906 bp,쌍매절출현량조대,기중약906 bp처가견목적조대.핵산측서결과여GcnBank중소보도적인Orai1기인적CDS서렬완전일치.전염후48h치형광현미경하관찰,85％이상적족세포중가견록색형광.RT-PCR급Wcstcrn blot실험결과분별현시전염후적MPC5세포재mRNA여단백수평표체Orai1균유소증강.결론 성공구건료중조인Orai1기인진핵표체재체PG-CMV-Orai1,병건립료과표체Orail기인적신소구족세포모형,위심입연구개고조종적Ca2+통도여족세포병지간적관계전정료량호적실험기출.
