医学研究杂志
醫學研究雜誌
의학연구잡지
JOURNAL OF MEDICAL RESEARCH
2014年
4期
21-25
,共5页
郭娇%徐新民%干伟%史飞%钱建畅%周晓阳%蔡剑平
郭嬌%徐新民%榦偉%史飛%錢建暢%週曉暘%蔡劍平
곽교%서신민%간위%사비%전건창%주효양%채검평
NDX-4%HPLC-UV%8-oxodGTP%8-oxoGTP%酶活性
NDX-4%HPLC-UV%8-oxodGTP%8-oxoGTP%酶活性
NDX-4%HPLC-UV%8-oxodGTP%8-oxoGTP%매활성
NDX-4%HPLC-UV%8-oxodGTP%8-oxoGTP%Enzymatic activity
目的 构建秀丽隐杆线虫NDX-4基因的克隆载体和表达载体,诱导NDX-4蛋白表达,研究NDX-4的体外酶学活性.方法 构建NDX-4的克隆载体,将NDX-4的开放阅读框架(ORF)插入PGEM-T载体中扩增;采用双酶切将NDX-4ORF连入表达载体pET-30a(+)中;将连接质粒转入BL21(DE3)感受态细胞后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对NDX-4蛋白进行表达诱导,并进行树脂纯化;用SDS-PAGE和Western blot检测以评价NDX-4体外表达和纯化的质量;采用高效液相色谱-紫外检测技术(HPLC-UV)检测NDX-4蛋白水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的活性.结果 SDS-PAGE和Western blot 检测均在经IPTG诱导的蛋白提纯物泳道上出现单一条带,分子质量约为24kDa,而未诱导的和空载体均未见条带.HPLC-UV检测结果显示加入NDX-4蛋白的8-oxodGTP和8-oxoGTP均被水解为相应的单磷酸和二磷酸氧化核苷,并且随着蛋白量的增加,两种产物的量逐渐增多.结论 秀丽隐杆线虫的NDX-4蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的双重功能,可能对抑制DNA和RNA的氧化损伤具有重要意义.
目的 構建秀麗隱桿線蟲NDX-4基因的剋隆載體和錶達載體,誘導NDX-4蛋白錶達,研究NDX-4的體外酶學活性.方法 構建NDX-4的剋隆載體,將NDX-4的開放閱讀框架(ORF)插入PGEM-T載體中擴增;採用雙酶切將NDX-4ORF連入錶達載體pET-30a(+)中;將連接質粒轉入BL21(DE3)感受態細胞後,用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對NDX-4蛋白進行錶達誘導,併進行樹脂純化;用SDS-PAGE和Western blot檢測以評價NDX-4體外錶達和純化的質量;採用高效液相色譜-紫外檢測技術(HPLC-UV)檢測NDX-4蛋白水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的活性.結果 SDS-PAGE和Western blot 檢測均在經IPTG誘導的蛋白提純物泳道上齣現單一條帶,分子質量約為24kDa,而未誘導的和空載體均未見條帶.HPLC-UV檢測結果顯示加入NDX-4蛋白的8-oxodGTP和8-oxoGTP均被水解為相應的單燐痠和二燐痠氧化覈苷,併且隨著蛋白量的增加,兩種產物的量逐漸增多.結論 秀麗隱桿線蟲的NDX-4蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的雙重功能,可能對抑製DNA和RNA的氧化損傷具有重要意義.
목적 구건수려은간선충NDX-4기인적극륭재체화표체재체,유도NDX-4단백표체,연구NDX-4적체외매학활성.방법 구건NDX-4적극륭재체,장NDX-4적개방열독광가(ORF)삽입PGEM-T재체중확증;채용쌍매절장NDX-4ORF련입표체재체pET-30a(+)중;장련접질립전입BL21(DE3)감수태세포후,용이병기류대반유당감(IPTG)대NDX-4단백진행표체유도,병진행수지순화;용SDS-PAGE화Western blot검측이평개NDX-4체외표체화순화적질량;채용고효액상색보-자외검측기술(HPLC-UV)검측NDX-4단백수해8-oxodGTP화8-oxoGTP적활성.결과 SDS-PAGE화Western blot 검측균재경IPTG유도적단백제순물영도상출현단일조대,분자질량약위24kDa,이미유도적화공재체균미견조대.HPLC-UV검측결과현시가입NDX-4단백적8-oxodGTP화8-oxoGTP균피수해위상응적단린산화이린산양화핵감,병차수착단백량적증가,량충산물적량축점증다.결론 수려은간선충적NDX-4단백구유수해8-oxodGTP화8-oxoGTP적쌍중공능,가능대억제DNA화RNA적양화손상구유중요의의.
