浙江大学学报（医学版）
浙江大學學報（醫學版）
절강대학학보（의학판）
JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY MEDICAL SCIENCES
2014年
2期
168-174
,共7页
柴晓鹃%胡海红%余露山%曾苏
柴曉鵑%鬍海紅%餘露山%曾囌
시효견%호해홍%여로산%증소
谷胱甘肽转移酶/生物合成%克隆, 分子%基因表达%色谱法, 亲和%基因扩增%质粒%逆转录聚合酶链反应
穀胱甘肽轉移酶/生物閤成%剋隆, 分子%基因錶達%色譜法, 親和%基因擴增%質粒%逆轉錄聚閤酶鏈反應
곡광감태전이매/생물합성%극륭, 분자%기인표체%색보법, 친화%기인확증%질립%역전록취합매련반응
Glutathione transferase /biosynthesis%Cloning,molecular%Gene expression%Chromatography,affinity%Gene amplification%Plasmids%Reverse transcriptase polymerase chain reaction
目的：克隆表达人谷胱甘肽硫转移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1，用于研究化合物的代谢途径。方法：采用反转录PCR得到人谷胱甘肽硫转移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1基因全长cDNA。将测序正确的cDNA连接到pET-28 a阳性表达载体上并在大肠杆菌BL21（ DE3）中稳定表达。利用亲和色谱纯化表达得到重组酶，以2，4-二硝基氯苯为底物，测定340 nm波长处吸收度的变化，检测酶活性。结果：PCR产物与克隆载体pMD19-T连接后的质粒测序结果表明，目的基因的cDNA序列完全正确。表达质粒在大肠杆菌BL21（ DE3）中获得良好的可溶性表达，经镍离子亲和柱纯化后目的蛋白较纯，具有较好的催化活性。所表达的 hGSTA1、hGSTT1和hGSTP1酶比活性分别为17．55、0．02、18．75μmol· min-1· mg-1蛋白。结论：成功构建了人谷胱甘肽硫转移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1的原核表达系统，得到的重组酶可用于药物代谢研究。
目的：剋隆錶達人穀胱甘肽硫轉移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1，用于研究化閤物的代謝途徑。方法：採用反轉錄PCR得到人穀胱甘肽硫轉移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1基因全長cDNA。將測序正確的cDNA連接到pET-28 a暘性錶達載體上併在大腸桿菌BL21（ DE3）中穩定錶達。利用親和色譜純化錶達得到重組酶，以2，4-二硝基氯苯為底物，測定340 nm波長處吸收度的變化，檢測酶活性。結果：PCR產物與剋隆載體pMD19-T連接後的質粒測序結果錶明，目的基因的cDNA序列完全正確。錶達質粒在大腸桿菌BL21（ DE3）中穫得良好的可溶性錶達，經鎳離子親和柱純化後目的蛋白較純，具有較好的催化活性。所錶達的 hGSTA1、hGSTT1和hGSTP1酶比活性分彆為17．55、0．02、18．75μmol· min-1· mg-1蛋白。結論：成功構建瞭人穀胱甘肽硫轉移酶GSTA1、GSTT1和GSTP1的原覈錶達繫統，得到的重組酶可用于藥物代謝研究。
목적：극륭표체인곡광감태류전이매GSTA1、GSTT1화GSTP1，용우연구화합물적대사도경。방법：채용반전록PCR득도인곡광감태류전이매GSTA1、GSTT1화GSTP1기인전장cDNA。장측서정학적cDNA련접도pET-28 a양성표체재체상병재대장간균BL21（ DE3）중은정표체。이용친화색보순화표체득도중조매，이2，4-이초기록분위저물，측정340 nm파장처흡수도적변화，검측매활성。결과：PCR산물여극륭재체pMD19-T련접후적질립측서결과표명，목적기인적cDNA서렬완전정학。표체질립재대장간균BL21（ DE3）중획득량호적가용성표체，경얼리자친화주순화후목적단백교순，구유교호적최화활성。소표체적 hGSTA1、hGSTT1화hGSTP1매비활성분별위17．55、0．02、18．75μmol· min-1· mg-1단백。결론：성공구건료인곡광감태류전이매GSTA1、GSTT1화GSTP1적원핵표체계통，득도적중조매가용우약물대사연구。
Objective: To construct the vectors of human glutathione S-transferase A1 (GSTA1), P1 (GSTP1), T1(GSTT1) genes and express in Escherichia coli (E. coli).Methods: Human GSTA1, GSTP1 and GSTT1 gene whole length cDNAs were amplified by RT-PCR and then subcloned into pET-28a(+) vectors.The proteins were expressed in E.coli BL21(DE3).After purified by Ni2+affinity chromatography, the enzymatic activities of GSTs were measured with 1-chloro-2,4 -dinitrobenzene (CDNB) as substrate .Results:The correct GSTA1, GSTP1 and GSTT1 genes were cloned .And soluble GSTA1, GSTT1, GSTP1 proteins were expressed in E.coli.After purification, GSTA1, GSTT1 and GSTP1 showed good enzymatic activities , which were 17.55, 0.02, 18.75 μmol· min-1 · mg-1 , respectively.Conclusion: The expression plasmids for GSTA1, GSTT1 and GSTP1 have been constructed and the recombinant proteins are expressed successfully .
