解剖学报
解剖學報
해부학보
ACTA ANATOMICA SINICA
2014年
2期
196-203
,共8页
田晓红%柏树令%范军%侯伟健%佟浩%徐赫
田曉紅%柏樹令%範軍%侯偉健%佟浩%徐赫
전효홍%백수령%범군%후위건%동호%서혁
RNA干扰%端锚聚合酶1%神经母细胞瘤%Wnt/β-catenin信号通路%免疫印迹法%人
RNA榦擾%耑錨聚閤酶1%神經母細胞瘤%Wnt/β-catenin信號通路%免疫印跡法%人
RNA간우%단묘취합매1%신경모세포류%Wnt/β-catenin신호통로%면역인적법%인
RNA interference%Tankyrase 1%Neuroblastoma%Wnt/β-catenin signaling pathway%Western blotting%Human
目的 探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对入神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础.方法 根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列.慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出最佳干扰序列进行后续实验.然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变.并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,最后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制.结果 慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L.Real-time PCR检测结果显示,#3shRNA为最佳的有效靶点.克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降.Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达.此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低.透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态.结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用.
目的 探討RNA榦擾(RNAi)介導的耑錨聚閤酶1(TNKS1)的錶達下調對入神經母細胞瘤(NB)細胞SH-SY5Y體外增殖能力和凋亡的影響及機製,為開髮治療NB的新靶點提供一定的實驗基礎.方法 根據TNKS1基因序列,設計閤成3箇TNKS1基因的特異性短髮夾環(shRNA)榦擾片段,利用慢病毒作為載體,構建目的基因的RNAi序列.慢病毒感染SH-SY5Y細胞,實時定量PCR(Real-time PCR)法檢測TNKS1基因的錶達,篩選齣最佳榦擾序列進行後續實驗.然後進行剋隆形成實驗,檢測RNAi-TNKS1後細胞增殖能力的改變.併進一步用Western blotting法檢測抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路的關鍵蛋白β-catenin及其下遊靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的錶達,最後用透射電鏡觀察凋亡形態的改變,探討RNAi-TNKS1對細胞凋亡的影響及其作用機製.結果 慢病毒載體構建成功,病毒滴度為5×1011TU/L.Real-time PCR檢測結果顯示,#3shRNA為最佳的有效靶點.剋隆形成實驗的結果顯示,RNAi-TNKS1後SH-SY5Y細胞的剋隆形成率較對照組明顯下降.Western blotting結果顯示,RNAi-TNKS1可顯著抑製Bcl-2蛋白的錶達,促進Caspase-3蛋白的錶達.此外,Wnt/β-catenin通路的關鍵蛋白β-catenin及其下遊靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的錶達也降低.透射電鏡結果顯示,RNAi-TNKS1後細胞呈現明顯的凋亡結構和形態.結論 RNAi介導的TNKS1的錶達下調可降低SH-SY5Y細胞的體外增殖能力,誘導其凋亡,可能部分是通過抑製Wnt/β-catenin通路髮揮作用.
목적 탐토RNA간우(RNAi)개도적단묘취합매1(TNKS1)적표체하조대입신경모세포류(NB)세포SH-SY5Y체외증식능력화조망적영향급궤제,위개발치료NB적신파점제공일정적실험기출.방법 근거TNKS1기인서렬,설계합성3개TNKS1기인적특이성단발협배(shRNA)간우편단,이용만병독작위재체,구건목적기인적RNAi서렬.만병독감염SH-SY5Y세포,실시정량PCR(Real-time PCR)법검측TNKS1기인적표체,사선출최가간우서렬진행후속실험.연후진행극륭형성실험,검측RNAi-TNKS1후세포증식능력적개변.병진일보용Western blotting법검측항조망단백Bcl-2、촉조망단백Caspase-3、Wnt/β-련배단백(β-catenin)통로적관건단백β-catenin급기하유파단백Cyclin D1화c-Myc적표체,최후용투사전경관찰조망형태적개변,탐토RNAi-TNKS1대세포조망적영향급기작용궤제.결과 만병독재체구건성공,병독적도위5×1011TU/L.Real-time PCR검측결과현시,#3shRNA위최가적유효파점.극륭형성실험적결과현시,RNAi-TNKS1후SH-SY5Y세포적극륭형성솔교대조조명현하강.Western blotting결과현시,RNAi-TNKS1가현저억제Bcl-2단백적표체,촉진Caspase-3단백적표체.차외,Wnt/β-catenin통로적관건단백β-catenin급기하유파단백Cyclin D1화c-Myc적표체야강저.투사전경결과현시,RNAi-TNKS1후세포정현명현적조망결구화형태.결론 RNAi개도적TNKS1적표체하조가강저SH-SY5Y세포적체외증식능력,유도기조망,가능부분시통과억제Wnt/β-catenin통로발휘작용.
