中华细胞与干细胞杂志（电子版）
中華細胞與榦細胞雜誌（電子版）
중화세포여간세포잡지（전자판）
CHINESE JOURNAL OF CELL AND STEM CELL
2014年
1期
36-43
,共8页
蒋超%石厚霞%丁思加%赵晨
蔣超%石厚霞%丁思加%趙晨
장초%석후하%정사가%조신
潜能干细胞%视网膜%上皮细胞%细胞分化%信号通路
潛能榦細胞%視網膜%上皮細胞%細胞分化%信號通路
잠능간세포%시망막%상피세포%세포분화%신호통로
Induced pluripotent stem cell%Retina%Epithelial cell%Differenti ation%Signaling pathway
目的：探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞，悬浮培养后形成拟胚体EB，诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法，观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白（RPE65、LRAT、zo-1）的表达。同时通过Q-PCR，Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点（分化1个月、2个月、3个月）上，iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路，进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间比较。结果荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时，表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较，Q-PCR结果显示，实验组RPE65在分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为0.84±0.13，4.8±1.1，20.3±4.9(P=0.000)；Best1分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为1.5±0.16，2.3±0.68，11.78±1.57(P=0.000)；MerTK在分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为4.12±1.94，1.87±0.76，15.53±1.33(P=0.000)，CK18分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为2.4±0.63，2.3±0.37，9.67±1.44(P=0.000)，Western Blotting结果也表明，随着分化时间延长，iPS-RPE细胞中特异性蛋白（BEST1、catenin、MerTK）表达量有显著提高，而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组（加DMSO）比较，雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表达量上升不是很明显，catenin蛋白显著提高。结论建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞，随iPS-RPE细胞分化时间延长，mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。
目的：探討mTOR信號通路在iPS定嚮分化RPE細胞中的調控機製。方法培養iPS細胞，懸浮培養後形成擬胚體EB，誘導分化為RPE細胞。通過免疫細胞化學的方法，觀察iPS-RPE細胞分化一箇月後特異性蛋白（RPE65、LRAT、zo-1）的錶達。同時通過Q-PCR，Western Blotting的方法檢測iPS-RPE在不同分化時間點（分化1箇月、2箇月、3箇月）上，iPS-RPE細胞中特異性基因、蛋白的錶達變化以及mTOR信號通路的活性。最後應用雷帕黴素抑製iPS-RPE細胞中mTOR的通路，進一步觀察iPS-RPE細胞中的蛋白錶達變化。Q-PCR採用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行組間比較。結果熒光顯微鏡觀察到iPS-RPE細胞在分化1箇月時，錶達RPE65、LRAT、zo-1蛋白。與對照組iPS比較，Q-PCR結果顯示，實驗組RPE65在分化1箇月，2箇月，3箇月時的錶達量分彆為0.84±0.13，4.8±1.1，20.3±4.9(P=0.000)；Best1分化1箇月，2箇月，3箇月時的錶達量分彆為1.5±0.16，2.3±0.68，11.78±1.57(P=0.000)；MerTK在分化1箇月，2箇月，3箇月時的錶達量分彆為4.12±1.94，1.87±0.76，15.53±1.33(P=0.000)，CK18分化1箇月，2箇月，3箇月時的錶達量分彆為2.4±0.63，2.3±0.37，9.67±1.44(P=0.000)，Western Blotting結果也錶明，隨著分化時間延長，iPS-RPE細胞中特異性蛋白（BEST1、catenin、MerTK）錶達量有顯著提高，而mTOR信號通路的活性受到抑製。與對照組（加DMSO）比較，雷帕黴素處理穫得的iPS-RPE細胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白錶達量上升不是很明顯，catenin蛋白顯著提高。結論建立瞭體外高等分化、功能高效的iPS-RPE細胞，隨iPS-RPE細胞分化時間延長，mTOR信號通路的活性是逐步抑製的。
목적：탐토mTOR신호통로재iPS정향분화RPE세포중적조공궤제。방법배양iPS세포，현부배양후형성의배체EB，유도분화위RPE세포。통과면역세포화학적방법，관찰iPS-RPE세포분화일개월후특이성단백（RPE65、LRAT、zo-1）적표체。동시통과Q-PCR，Western Blotting적방법검측iPS-RPE재불동분화시간점（분화1개월、2개월、3개월）상，iPS-RPE세포중특이성기인、단백적표체변화이급mTOR신호통로적활성。최후응용뢰파매소억제iPS-RPE세포중mTOR적통로，진일보관찰iPS-RPE세포중적단백표체변화。Q-PCR채용단인소방차분석（One-Way ANOVA）진행조간비교。결과형광현미경관찰도iPS-RPE세포재분화1개월시，표체RPE65、LRAT、zo-1단백。여대조조iPS비교，Q-PCR결과현시，실험조RPE65재분화1개월，2개월，3개월시적표체량분별위0.84±0.13，4.8±1.1，20.3±4.9(P=0.000)；Best1분화1개월，2개월，3개월시적표체량분별위1.5±0.16，2.3±0.68，11.78±1.57(P=0.000)；MerTK재분화1개월，2개월，3개월시적표체량분별위4.12±1.94，1.87±0.76，15.53±1.33(P=0.000)，CK18분화1개월，2개월，3개월시적표체량분별위2.4±0.63，2.3±0.37，9.67±1.44(P=0.000)，Western Blotting결과야표명，수착분화시간연장，iPS-RPE세포중특이성단백（BEST1、catenin、MerTK）표체량유현저제고，이mTOR신호통로적활성수도억제。여대조조（가DMSO）비교，뢰파매소처리획득적iPS-RPE세포중BEST1、MerTK、ck18단백표체량상승불시흔명현，catenin단백현저제고。결론건립료체외고등분화、공능고효적iPS-RPE세포，수iPS-RPE세포분화시간연장，mTOR신호통로적활성시축보억제적。
Objective To explore the role of mTOR signaling pathway in the regulation of differentiation of iPS into retinal pigment epithelial (RPE) cells. Methods After embryoid bodies were formed by cultured iPS in suspension condition, they were induced to differentiate into RPE cells. The expressions of RPE specific proteins (RPE65, LRAT, ZO-1) in iPS-RPE cells during differentiation were detected by immunocytochemistry. Q-PCR and Western Blotting were carried out to analyze RPE specific genes, proteins and mTOR activity in iPS-RPE at different time points of differentiation (after one month, two months, three months). Finally, iPS-RPE were treated with mTOR inhibitor rapamycin and RPE specific protein expression was evaluated. Results The RPE specific proteins (RPE65, LRAT, zo-1) of iPS-RPE cells were observed after one month of differentiation by fluorescence microscope. Compared with the control iPS, Q-PCR results showed that iPS-RPE exhibited significant higher level of RPE specific genes (RPE65, Best1, MerTK, CK18) after three months of differentiation (P<0.01). Western Blotting also showed that the expressions of RPE specific proteins BEST1, catenin and MerTK significantly increased in iPS-RPE cells as differentiation process went on. The activity of the mTOR was inhibited in this process. In addition, rapamycin treated cells exhibited higher expression of catenin, but expression of BEST1, MerTK and CK18 was not changed. Conclusions We established an efficient method to obtain iPS-RPE cells. And mTOR signaling pathway is gradually suppressed during the process of iPS differentiation into RPE cells in vitro.
