上海交通大学学报（医学版）
上海交通大學學報（醫學版）
상해교통대학학보（의학판）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)
2008年
7期
811-814
,共4页
程岚%束蓉%薛京伦%陈金中%田聆%方煜翔
程嵐%束蓉%薛京倫%陳金中%田聆%方煜翔
정람%속용%설경륜%진금중%전령%방욱상
重组人釉原蛋白%原核表达载体%融合蛋白
重組人釉原蛋白%原覈錶達載體%融閤蛋白
중조인유원단백%원핵표체재체%융합단백
目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.
目的 構建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重組原覈錶達質粒,在大腸桿菌中錶達重組人釉原蛋白,鑒定經純化穫得的融閤蛋白.方法 利用限製性內切酶EcoR I和Sal I將hAm基因插入原覈錶達載體PGEX4T1,對重組錶達質粒PGEX4T1-hAm進行雙酶切和測序鑒定.選擇測序正確的質粒轉化E.coli.RosettaTM,用終濃度0.3 mmol/L的IPTG誘導錶達帶有親和標記穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)的重組hAm.經親和層析純化穫得融閤蛋白GST-hAm,併通過SDS-PAGE和Western blotting鑒定原覈錶達的重組hAm.結果 重組質粒經雙酶切和測序鑒定證實插入序列準確無誤.在大腸桿菌RosettaTM中經IPTG誘導錶達併純化得到的融閤蛋白GST-hAm,經SDS-PAGE鑒定分子量約為46 000,主要以包涵體形式存在,與預測一緻;Western blotting證實該融閤蛋白能被特異性抗hAm多剋隆抗體識彆.結論 成功構建含有hAm成熟肽基因的重組原覈錶達質粒,錶達的融閤蛋白GST-hAm可通過純化穫得,經鑒定為hAm.大量純化的hAm成熟肽的穫得為開展其功能研究奠定瞭基礎.
목적 구건함인유원단백(hAm)성숙태기인적중조원핵표체질립,재대장간균중표체중조인유원단백,감정경순화획득적융합단백.방법 이용한제성내절매EcoR I화Sal I장hAm기인삽입원핵표체재체PGEX4T1,대중조표체질립PGEX4T1-hAm진행쌍매절화측서감정.선택측서정학적질립전화E.coli.RosettaTM,용종농도0.3 mmol/L적IPTG유도표체대유친화표기곡광감태-S-전이매(GST)적중조hAm.경친화층석순화획득융합단백GST-hAm,병통과SDS-PAGE화Western blotting감정원핵표체적중조hAm.결과 중조질립경쌍매절화측서감정증실삽입서렬준학무오.재대장간균RosettaTM중경IPTG유도표체병순화득도적융합단백GST-hAm,경SDS-PAGE감정분자량약위46 000,주요이포함체형식존재,여예측일치;Western blotting증실해융합단백능피특이성항hAm다극륭항체식별.결론 성공구건함유hAm성숙태기인적중조원핵표체질립,표체적융합단백GST-hAm가통과순화획득,경감정위hAm.대량순화적hAm성숙태적획득위개전기공능연구전정료기출.
