CAJ | 학술논문

背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达.目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供.含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建.方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用Sac I/Kpn I及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区.分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因.主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达.PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上.结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株.β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0,PCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131.②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上.结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性.
배경:핵기질부착구시염색질피한제매소화후잉부착재핵기질상적DNA서렬,불부가영향린근내원기인적표체,환능극복전기인침묵,제고외원기인적전록여표체.목적:탐토재CHO세포중β-간우소핵기질부착구대록매소을선전이매전기인표체적영향.설계、시간급지점:개방성실험,우2006-10/2007-04재신향의학원생물화학여분자생물학실험실급분자연구실완성.재료:CHO세포주유중국전형배양물보장중심제공.함록매소을선전이매보고기인급G418사선표기적질립pCATG재체유본실험실구건.방법:장PCR확증득도적인β-간우소핵기질부착구분별용Sac I/Kpn I급BamHI/SalI매절,련접지용상응내절매매절적pCATG재체상,전화E.coliJM109,제취질립행매절전영,장구건호적재체명명위pCAT-MAR,해재체함록매소을선전이매보고기인표체합급량측적β-간우소핵기질부착구.분별용재체pCATG급pCAT-MAR전화CHO세포,제취구유G418항성적세포주기인조DNA,PCR확증록매소을선전이매기인.주요관찰지표:ELISA법분석록매소을선전이매보고기인적표체.PCR법검측pCAT-MAR재체시부은정정합재숙주기인조상.결과:①pCATG전화적CHO세포공사선출16개양성세포주,pCAT-MAR전화적CHO세포사선출17개양성세포주.β-간우소핵기질부착구가사록매소을선전이매보고기인표체수평제고2.8배,pCATG전화CHO세포적변이계수위2.065 0,PCAT-MAR전화CHO세포적변이계수부위0.8131.②은정전화적세포주기인조DNA균확증출437 bp목적편단,증명pCAT-MAR재체이경은정정합도기인조상.결론:β-간우소핵기질부착구능제고전기인재CHO세포적표체수평,병차가강저불동전화세포주지간전기인표체적차이성.