中国修复重建外科杂志
中國脩複重建外科雜誌
중국수복중건외과잡지
CHINESE JOURNAL OF REPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE SURGERY
2008年
8期
969-973
,共5页
王栋琪%刘淼%王民%张银刚
王棟琪%劉淼%王民%張銀剛
왕동기%류묘%왕민%장은강
重组腺病毒%c-myc%短发夹RNA%骨肉瘤%基因沉默
重組腺病毒%c-myc%短髮夾RNA%骨肉瘤%基因沉默
중조선병독%c-myc%단발협RNA%골육류%기인침묵
目的 设计、构建并筛选出转染至人骨肉瘤细胞系OS-9901,对c-myc沉默效果最佳的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd-c-myc-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包装出表达c-myc-shRNA的重组腺病毒,并测定其滴度.方法 设计有shRNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligos),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligos),插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后,经LipofectamineTM2000阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,采用RTPCR筛选对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子.采用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒,观察其细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用病毒颗粒法(viral particles,VP)和50%组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定病毒滴度.结果 电泳验证后的ds oligos插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.从3对ds oligos通过RT-PCR方法筛选出对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒,CPE和空泡现象3 d开始出现,6 d更加明显.采用VP法测定的第1代腺病毒滴度为5.23×109VP/mL,经3～4代扩增后可达2.26×1012 VP/mL.TCID50证实病毒滴度为10-3.8/0.1 mL.结论 通过RNA干扰技术,体外成功构建了介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.
目的 設計、構建併篩選齣轉染至人骨肉瘤細胞繫OS-9901,對c-myc沉默效果最佳的複製缺陷型重組腺病毒質粒pAd-c-myc-短髮夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)包裝齣錶達c-myc-shRNA的重組腺病毒,併測定其滴度.方法 設計有shRNA結構的3對單鏈寡覈苷痠(ss oligos),經變性退火為雙鏈寡覈苷痠(ds oligos),插入穿梭質粒pENTR/U6載體,測序正確後,經LipofectamineTM2000暘離子脂質體介導入人骨肉瘤細胞繫OS-9901,採用RTPCR篩選對c-myc沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA,然後與腺病毒骨架質粒行同源重組,篩選齣正確重組子.採用293A細胞包裝齣錶達c-myc-shRNA的複製缺陷型重組腺病毒,觀察其細胞病變效應(cytopathic effect,CPE),採用病毒顆粒法(viral particles,VP)和50%組織培養感染劑量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)測定病毒滴度.結果 電泳驗證後的ds oligos插入穿梭質粒pENTR/U6載體,測序結果提示構建的pENTR/U6-shRNA質粒正確.從3對ds oligos通過RT-PCR方法篩選齣對c-myc沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA,經Pac Ⅰ酶切線性化後同源重組成功構建瞭介導c-myc-shRNA複製缺陷型重組腺病毒,CPE和空泡現象3 d開始齣現,6 d更加明顯.採用VP法測定的第1代腺病毒滴度為5.23×109VP/mL,經3～4代擴增後可達2.26×1012 VP/mL.TCID50證實病毒滴度為10-3.8/0.1 mL.結論 通過RNA榦擾技術,體外成功構建瞭介導shRNA-c-myc複製缺陷型重組腺病毒.
목적 설계、구건병사선출전염지인골육류세포계OS-9901,대c-myc침묵효과최가적복제결함형중조선병독질립pAd-c-myc-단발협RNA(short hairpin RNA,shRNA)포장출표체c-myc-shRNA적중조선병독,병측정기적도.방법 설계유shRNA결구적3대단련과핵감산(ss oligos),경변성퇴화위쌍련과핵감산(ds oligos),삽입천사질립pENTR/U6재체,측서정학후,경LipofectamineTM2000양리자지질체개도입인골육류세포계OS-9901,채용RTPCR사선대c-myc침묵효과최가적천사질립pENTR/U6-shRNA,연후여선병독골가질립행동원중조,사선출정학중조자.채용293A세포포장출표체c-myc-shRNA적복제결함형중조선병독,관찰기세포병변효응(cytopathic effect,CPE),채용병독과립법(viral particles,VP)화50%조직배양감염제량법(50%tissue culture infective dose,TCID50)측정병독적도.결과 전영험증후적ds oligos삽입천사질립pENTR/U6재체,측서결과제시구건적pENTR/U6-shRNA질립정학.종3대ds oligos통과RT-PCR방법사선출대c-myc침묵효과최가적천사질립pENTR/U6-shRNA,경Pac Ⅰ매절선성화후동원중조성공구건료개도c-myc-shRNA복제결함형중조선병독,CPE화공포현상3 d개시출현,6 d경가명현.채용VP법측정적제1대선병독적도위5.23×109VP/mL,경3～4대확증후가체2.26×1012 VP/mL.TCID50증실병독적도위10-3.8/0.1 mL.결론 통과RNA간우기술,체외성공구건료개도shRNA-c-myc복제결함형중조선병독.
