生物化学与生物物理进展
生物化學與生物物理進展
생물화학여생물물리진전
PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS
2009年
12期
1617-1625
,共9页
孔庆然%武美玲%朱江%格日乐其木格%郇延军%尹智%牟彦双%刘忠华
孔慶然%武美玲%硃江%格日樂其木格%郇延軍%尹智%牟彥雙%劉忠華
공경연%무미령%주강%격일악기목격%순연군%윤지%모언쌍%류충화
转基因猪%拷贝数%整合位点%绝对定量PCR%TAIL-PCR%纯合性
轉基因豬%拷貝數%整閤位點%絕對定量PCR%TAIL-PCR%純閤性
전기인저%고패수%정합위점%절대정량PCR%TAIL-PCR%순합성
transgenic pig%copy number%integration site%absolute quantitative PCR%TAIL-PCR%zygosity
主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Juncuion PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性.结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为:log_2N(拷贝数)=-0.935 4△Ct+3.411 6(R~2=0.997 4,P＜0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1(1440 bp)、TgInS2(1263 bp)和TghIs3(1861 bp)3个整合位点.以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性.采用整合位点5'游和3'下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子.初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础.
主要採用瞭絕對定量PCR和熱不均一交錯PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),檢測瞭體細胞覈移植技術生產的綠色熒光蛋白轉基因豬中外源基因拷貝數和整閤位點,併利用徬側PCR(Juncuion PCR)對整閤位點進行確定,同時進一步分析瞭整閤位點的純閤性.結果錶明,絕對定量PCR可以準確有效地檢測外源基因拷貝數,標準麯線為:log_2N(拷貝數)=-0.935 4△Ct+3.411 6(R~2=0.997 4,P＜0.001),兩隻轉基因豬中外源基因拷貝數分彆為30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地剋隆轉基因豬中外源基因整閤位點,得到25條特異性條帶,經BLAST比對,共穫得TgInS1(1440 bp)、TgInS2(1263 bp)和TghIs3(1861 bp)3箇整閤位點.以整閤位點側翼序列特異性引物與外源基因特異性引物的組閤引髮Junction PCR,得到預計大小的特異性片段,確定瞭整閤位點上、下遊側翼序列的準確性.採用整閤位點5'遊和3'下遊側翼序列特異性引物與外源基因特異性引物的組閤,進行Junction PCR,在兩隻轉基因豬中都得到與野生型豬一緻的側翼序列特異性引物擴增片段,錶明我們穫得的轉基因豬都為整閤位點雜閤子.初步建立瞭絕對定量PCR和TAIL-PCR對外源基因拷貝數和整閤位點檢測的體繫,為今後研究外源基因在轉基因豬中遺傳和錶達的穩定性打下瞭基礎.
주요채용료절대정량PCR화열불균일교착PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),검측료체세포핵이식기술생산적록색형광단백전기인저중외원기인고패수화정합위점,병이용방측PCR(Juncuion PCR)대정합위점진행학정,동시진일보분석료정합위점적순합성.결과표명,절대정량PCR가이준학유효지검측외원기인고패수,표준곡선위:log_2N(고패수)=-0.935 4△Ct+3.411 6(R~2=0.997 4,P＜0.001),량지전기인저중외원기인고패수분별위30.85±1.77화18.87±1.34;TAIL-PCR능성공지극륭전기인저중외원기인정합위점,득도25조특이성조대,경BLAST비대,공획득TgInS1(1440 bp)、TgInS2(1263 bp)화TghIs3(1861 bp)3개정합위점.이정합위점측익서렬특이성인물여외원기인특이성인물적조합인발Junction PCR,득도예계대소적특이성편단,학정료정합위점상、하유측익서렬적준학성.채용정합위점5'유화3'하유측익서렬특이성인물여외원기인특이성인물적조합,진행Junction PCR,재량지전기인저중도득도여야생형저일치적측익서렬특이성인물확증편단,표명아문획득적전기인저도위정합위점잡합자.초보건립료절대정량PCR화TAIL-PCR대외원기인고패수화정합위점검측적체계,위금후연구외원기인재전기인저중유전화표체적은정성타하료기출.
