CAJ | 학술논문

本研究通过构建β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt/β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞(MSC)生物学行为的影响.设计3对针对β-catenin mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin/shRNA1,PLB-β-catenin/shRNA2和PLB-β-catenin/shR-NA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MSC细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Western blot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率最高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V/7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力.结果表明:构建的特异性慢病毒siRNA干扰组(PLB-β-catenin/shRNA2)能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组(PLB group)和正常对照组(control group)细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异(P＞0.05);流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异(P＞0.05);细胞划痕和Tran-swell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化.结论:构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响.
본연구통과구건β-련배단백(β-catenin)특이적RNAi만병독표체재체,탐토조단Wnt/β-catenin신호통로대골수간충질간세포(MSC)생물학행위적영향.설계3대침대β-catenin mRNA불동위점적shRNA편마서렬,분별련접도만병독재체질립PLB중,구건PLB-β-catenin/shRNA1,PLB-β-catenin/shRNA2화PLB-β-catenin/shR-NA3;장중조질립여만병독포장질립급포막단백질립공전염293FT세포,수획병독과립,농축후측정병독적도,감염MSC세포,병응용류식세포술분선GFP양성세포,Western blot화RT-PCR험증기대세포내β-catenin기인표체적억제효과,사선간우효솔최고질립;CCK-8법검측세포증식,Annexin-V/7-AAD법검측간우후세포조망정황,세포화흔실험급Transwell실험검측MSC천이능력.결과표명:구건적특이성만병독siRNA간우조(PLB-β-catenin/shRNA2)능유효억제β-catenin적mRNA화단백표체,병억제세포적증식;이공재체대조조(PLB group)화정상대조조(control group)세포증식무명현변화,량조지간무현저적통계학차이(P＞0.05);류식세포술검측결과현시,채용혈청기아법처리후,간우조세포적조망솔명현증가,단량대조조지간무통계학차이(P＞0.05);세포화흔화Tran-swell실험현시,간우조MSC적천이능력명현강저,대조조세포천이능력무명현변화.결론:구건적특이RNAi만병독능구유효억제β-catenin기인적표체,감소세포내목적기인mRNA화단백적수평,종이대MSC세포적증식、조망화천이능력산생중요영향.