浙江农林大学学报
浙江農林大學學報
절강농림대학학보
JOURNAL OF ZHEJIANG FORESTRY COLLEGE
2013年
5期
789-796
,共8页
周生财%黄华宏%童再康%吴小林
週生財%黃華宏%童再康%吳小林
주생재%황화굉%동재강%오소림
林木育种学%浙江楠%紫楠%桢楠%闽楠%DNA提取%AFLP
林木育種學%浙江楠%紫楠%楨楠%閩楠%DNA提取%AFLP
림목육충학%절강남%자남%정남%민남%DNA제취%AFLP
forest tree breeding%Phoebe chekiangensis%Phoebe sheareri%Phoebe zhennan%Phoebe bournei%DNA extraction%AFLP
采用核酸电泳缓冲液(TNE)结合十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取的高质量楠木Phoebe基因组脱氧核糖核苷酸(DNA)可满足扩增片段长度多态性(AFLP)分析的要求.利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因组DNA优化建立楠木AFLP反应体系如下:酶切反应300 ng基因组DNA,0.3 μL缓冲液4,0.3 μL牛血清白蛋白(100×BSA),50 nkat EcoRⅠ,25 nkat MseⅠ,双蒸水加至30.0 μL放置37 ℃恒温箱酶切4h,聚合酶链式反应(PCR)仪上65℃15 min;连接反应20.0 μL酶切产物,2.5 μL T4缓冲液,666.8 nkat T4连接酶,5 pmol EcoRⅠ接头,10 pmol MseⅠ接头,双蒸水加至25.0 μL,16℃连接过夜(10 ～14 h);预扩增反应2.0 μL连接产物,2.0 μL 10×缓冲液,31.25 nmol镁离子,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,4 pmol脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),预扩增引物(E+A,M+C)各6 pmol,双蒸水加至20.0 μL;选扩增反应稀释40倍的预扩产物2.0 μL,2.0 μL 10×缓冲液,31.25 nmol镁离子,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,选扩增引物(M+CNN)15 pmol,选扩增引物(E+ANN) 12 pmol,双蒸水加至20.0 μL.利用上面体系在64对选扩引物中筛出13对适于浙江楠AFLP分析的最佳引物组合.
採用覈痠電泳緩遲液(TNE)結閤十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取的高質量楠木Phoebe基因組脫氧覈糖覈苷痠(DNA)可滿足擴增片段長度多態性(AFLP)分析的要求.利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因組DNA優化建立楠木AFLP反應體繫如下:酶切反應300 ng基因組DNA,0.3 μL緩遲液4,0.3 μL牛血清白蛋白(100×BSA),50 nkat EcoRⅠ,25 nkat MseⅠ,雙蒸水加至30.0 μL放置37 ℃恆溫箱酶切4h,聚閤酶鏈式反應(PCR)儀上65℃15 min;連接反應20.0 μL酶切產物,2.5 μL T4緩遲液,666.8 nkat T4連接酶,5 pmol EcoRⅠ接頭,10 pmol MseⅠ接頭,雙蒸水加至25.0 μL,16℃連接過夜(10 ～14 h);預擴增反應2.0 μL連接產物,2.0 μL 10×緩遲液,31.25 nmol鎂離子,16.67 nkat TaqDNA聚閤酶,4 pmol脫氧覈糖覈苷三燐痠(dNTP),預擴增引物(E+A,M+C)各6 pmol,雙蒸水加至20.0 μL;選擴增反應稀釋40倍的預擴產物2.0 μL,2.0 μL 10×緩遲液,31.25 nmol鎂離子,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA聚閤酶,選擴增引物(M+CNN)15 pmol,選擴增引物(E+ANN) 12 pmol,雙蒸水加至20.0 μL.利用上麵體繫在64對選擴引物中篩齣13對適于浙江楠AFLP分析的最佳引物組閤.
채용핵산전영완충액(TNE)결합십륙완기삼갑기추화안(CTAB)제취적고질량남목Phoebe기인조탈양핵당핵감산(DNA)가만족확증편단장도다태성(AFLP)분석적요구.이용절강남Phoebe chekiangensis기인조DNA우화건립남목AFLP반응체계여하:매절반응300 ng기인조DNA,0.3 μL완충액4,0.3 μL우혈청백단백(100×BSA),50 nkat EcoRⅠ,25 nkat MseⅠ,쌍증수가지30.0 μL방치37 ℃항온상매절4h,취합매련식반응(PCR)의상65℃15 min;련접반응20.0 μL매절산물,2.5 μL T4완충액,666.8 nkat T4련접매,5 pmol EcoRⅠ접두,10 pmol MseⅠ접두,쌍증수가지25.0 μL,16℃련접과야(10 ～14 h);예확증반응2.0 μL련접산물,2.0 μL 10×완충액,31.25 nmol미리자,16.67 nkat TaqDNA취합매,4 pmol탈양핵당핵감삼린산(dNTP),예확증인물(E+A,M+C)각6 pmol,쌍증수가지20.0 μL;선확증반응희석40배적예확산물2.0 μL,2.0 μL 10×완충액,31.25 nmol미리자,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA취합매,선확증인물(M+CNN)15 pmol,선확증인물(E+ANN) 12 pmol,쌍증수가지20.0 μL.이용상면체계재64대선확인물중사출13대괄우절강남AFLP분석적최가인물조합.
