中山大学学报（医学科学版）
中山大學學報（醫學科學版）
중산대학학보（의학과학판）
JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2012年
5期
603-609
,共7页
石华%邓军洪%郑少斌%王铸%曹开源%周亮%万华
石華%鄧軍洪%鄭少斌%王鑄%曹開源%週亮%萬華
석화%산군홍%정소빈%왕주%조개원%주량%만화
RNA干扰%慢病毒%clusterin%肾细胞癌%786-O
RNA榦擾%慢病毒%clusterin%腎細胞癌%786-O
RNA간우%만병독%clusterin%신세포암%786-O
[目的]应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和凋亡的影响.[方法]构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株.实验分5组:CLU-RNAi-LV1 (KDl)、CLU-RNAi-LV2(KD2)、CLU-RNAi-LV3 (KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组).应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化.用细胞划痕实验、MST-1、流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变.[结果]成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒.Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1、KD2、KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4％～96.5％和0.Western blot结果显示KD1、KD2、KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24％、46.26％和58.91％,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达.划痕实验显示24h时KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43±25.92)小于NC组(101.35±6.05)和CON组(68.13±6.64,P＜0.05).WST-1法检测转染后72 h KD3 (si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P＜ 0.05),各组间差异(P＜0.05),均有统计学意义.流式细胞仪检测KD3 (si-CLU)组与NC组、CON组细胞凋亡率分别为(6.23±2.51)％、(1.05±0.30)％和(1.17±0.29)％,KD3 (si-CLU)组与NC组、CON组相比凋亡率增加(P＜0.05),差异有统计学意义.肾癌786-O细胞的增殖、迁移受到抑制,而凋亡率增加.[结论]筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡.
[目的]應用慢病毒介導的RNA榦擾技術,檢測clusterin(CLU)基因沉默在人腎癌786-O細胞的榦擾效果及其對人腎癌786-O細胞增殖、遷移和凋亡的影響.[方法]構建靶嚮CLU基因的慢病毒榦擾載體,利用包裝細胞293T穫得重組慢病毒,感染人腎癌786-O細胞株.實驗分5組:CLU-RNAi-LV1 (KDl)、CLU-RNAi-LV2(KD2)、CLU-RNAi-LV3 (KD3)為加入靶嚮CLU基因的慢病毒感染的腎癌細胞組,未處理的慢病毒感染的腎癌細胞組(NC組),腎癌786-O細胞為空白對照組(CON組).應用Real time-PCR及Western blot檢測不同組彆榦擾前後CLU mRNA及蛋白錶達的變化.用細胞劃痕實驗、MST-1、流式細胞儀等方法檢測CLU沉默後腎癌786-O細胞在增殖、遷移、凋亡等生物學行為的改變.[結果]成功構建CLU shRNA慢病毒載體clu-RNAi-LV併穫得相應慢病毒.Real time-PCR顯示不同感染複數CLU-RNAi-LV處理的KD1、KD2、KD3組CLU mRNA錶達水平與對照組相比分彆下調69.4％～96.5％和0.Western blot結果顯示KD1、KD2、KD3組CLU蛋白錶達水平與CON組相比分彆下降35.24％、46.26％和58.91％,KD3能顯著抑製786-O細胞中CLU基因的錶達.劃痕實驗顯示24h時KD3(si-CLU)組細胞遷移相對距離(408.43±25.92)小于NC組(101.35±6.05)和CON組(68.13±6.64,P＜0.05).WST-1法檢測轉染後72 h KD3 (si-CLU)組細胞生長速度較NC組及CON組明顯下降(P＜ 0.05),各組間差異(P＜0.05),均有統計學意義.流式細胞儀檢測KD3 (si-CLU)組與NC組、CON組細胞凋亡率分彆為(6.23±2.51)％、(1.05±0.30)％和(1.17±0.29)％,KD3 (si-CLU)組與NC組、CON組相比凋亡率增加(P＜0.05),差異有統計學意義.腎癌786-O細胞的增殖、遷移受到抑製,而凋亡率增加.[結論]篩選齣能穩定榦擾CLU基因錶達的siRNA序列和腎癌786-O細胞株.CLU慢病毒榦擾載體可有效沉默腎癌786-O細胞的內源性CLU基因,抑製腎癌786-O細胞的增殖、遷移併促進細胞凋亡.
[목적]응용만병독개도적RNA간우기술,검측clusterin(CLU)기인침묵재인신암786-O세포적간우효과급기대인신암786-O세포증식、천이화조망적영향.[방법]구건파향CLU기인적만병독간우재체,이용포장세포293T획득중조만병독,감염인신암786-O세포주.실험분5조:CLU-RNAi-LV1 (KDl)、CLU-RNAi-LV2(KD2)、CLU-RNAi-LV3 (KD3)위가입파향CLU기인적만병독감염적신암세포조,미처리적만병독감염적신암세포조(NC조),신암786-O세포위공백대조조(CON조).응용Real time-PCR급Western blot검측불동조별간우전후CLU mRNA급단백표체적변화.용세포화흔실험、MST-1、류식세포의등방법검측CLU침묵후신암786-O세포재증식、천이、조망등생물학행위적개변.[결과]성공구건CLU shRNA만병독재체clu-RNAi-LV병획득상응만병독.Real time-PCR현시불동감염복수CLU-RNAi-LV처리적KD1、KD2、KD3조CLU mRNA표체수평여대조조상비분별하조69.4％～96.5％화0.Western blot결과현시KD1、KD2、KD3조CLU단백표체수평여CON조상비분별하강35.24％、46.26％화58.91％,KD3능현저억제786-O세포중CLU기인적표체.화흔실험현시24h시KD3(si-CLU)조세포천이상대거리(408.43±25.92)소우NC조(101.35±6.05)화CON조(68.13±6.64,P＜0.05).WST-1법검측전염후72 h KD3 (si-CLU)조세포생장속도교NC조급CON조명현하강(P＜ 0.05),각조간차이(P＜0.05),균유통계학의의.류식세포의검측KD3 (si-CLU)조여NC조、CON조세포조망솔분별위(6.23±2.51)％、(1.05±0.30)％화(1.17±0.29)％,KD3 (si-CLU)조여NC조、CON조상비조망솔증가(P＜0.05),차이유통계학의의.신암786-O세포적증식、천이수도억제,이조망솔증가.[결론]사선출능은정간우CLU기인표체적siRNA서렬화신암786-O세포주.CLU만병독간우재체가유효침묵신암786-O세포적내원성CLU기인,억제신암786-O세포적증식、천이병촉진세포조망.
