CAJ | 학술논문

内标准基因(endogenous reference gene)是指具有物种专一性、不显示等位基因变化、拷贝数恒定的保守DNA序列,对基因定量分析时具有重要意义.本研究选取了5个水稻内标准基因:根部表达的水稻基因(rice root-specific,GOS9)、磷脂酶D基因(phospholipase D,PLD)、蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase,SPS)、水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)、泛素蛋白基因(ubiquitin 5,UBQ5)和2个外源基因:苏云金芽孢杆菌CrylAb杀虫晶体蛋白基因CrylAb和cryl Ab/cryl Ac融合杀虫晶体蛋白基因(CrylA c/CrylAb),分别以转基因水稻(Oryza sativa L.)克螟稻2号和TT51-1为模板,比较各自的外源基因(CrylAb =KMD2和CrylA c/CrylA b=TT51-1)与5个内源基因的PCR产物量,筛选出和外源基因PCR产物量最接近的内标准基因为RBE4.在此基础上,数字PCR不依赖于已知浓度的标准曲线来定值,可以避免标准样品的标准曲线和样品目的基因的扩增曲线在扩增效率上的不一致等因素所带来的误差,定值结果更加准确、可靠,采用数字PCR分析外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值,荧光定量PCR方法分析内标准基因RBE4和外源基因的定量检测稳定性、灵敏度等.结果表明,外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值在转基因水稻克螟稻2号和TT51-1上都较接近于1∶1,分别为115.9％和105.3％.RBE4的荧光定量PCR体系重复性、定量检测稳定性和灵敏度好,符合作为转基因水稻基体标准物质定量分析的内标准基因的要求,RBE4定量体系在TT51-1和克螟稻2号的最小检出限(LOD)分别为5～11 copies/μL和3～12 copies/μL,最小定量限(LOQ)分别为11～22和12～24 copies/μL.RBE4是转基因水稻标准物质研制和产品定量检测的适宜内标准基因.研究结果为转基因作物标准物质研制和定量检测的内标准基因选取提供一定的参考.
내표준기인(endogenous reference gene)시지구유물충전일성、불현시등위기인변화、고패수항정적보수DNA서렬,대기인정량분석시구유중요의의.본연구선취료5개수도내표준기인:근부표체적수도기인(rice root-specific,GOS9)、린지매D기인(phospholipase D,PLD)、자당린산합성매기인(sucrose phosphate synthase,SPS)、수도정분분지매기인(rice starch branching enzyme,RBE4)、범소단백기인(ubiquitin 5,UBQ5)화2개외원기인:소운금아포간균CrylAb살충정체단백기인CrylAb화cryl Ab/cryl Ac융합살충정체단백기인(CrylA c/CrylAb),분별이전기인수도(Oryza sativa L.)극명도2호화TT51-1위모판,비교각자적외원기인(CrylAb =KMD2화CrylA c/CrylA b=TT51-1)여5개내원기인적PCR산물량,사선출화외원기인PCR산물량최접근적내표준기인위RBE4.재차기출상,수자PCR불의뢰우이지농도적표준곡선래정치,가이피면표준양품적표준곡선화양품목적기인적확증곡선재확증효솔상적불일치등인소소대래적오차,정치결과경가준학、가고,채용수자PCR분석외원기인고패수여내표준기인RBE4고패수적비치,형광정량PCR방법분석내표준기인RBE4화외원기인적정량검측은정성、령민도등.결과표명,외원기인고패수여내표준기인RBE4고패수적비치재전기인수도극명도2호화TT51-1상도교접근우1∶1,분별위115.9％화105.3％.RBE4적형광정량PCR체계중복성、정량검측은정성화령민도호,부합작위전기인수도기체표준물질정량분석적내표준기인적요구,RBE4정량체계재TT51-1화극명도2호적최소검출한(LOD)분별위5～11 copies/μL화3～12 copies/μL,최소정량한(LOQ)분별위11～22화12～24 copies/μL.RBE4시전기인수도표준물질연제화산품정량검측적괄의내표준기인.연구결과위전기인작물표준물질연제화정량검측적내표준기인선취제공일정적삼고.