华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2012年
5期
556-561
,共6页
向水%董念国%刘金平%史嘉玮%肖雅琼%王玉
嚮水%董唸國%劉金平%史嘉瑋%肖雅瓊%王玉
향수%동념국%류금평%사가위%초아경%왕옥
SOCS3%腺病毒载体%转基因治疗%血管平滑肌细胞%血管增殖性疾病
SOCS3%腺病毒載體%轉基因治療%血管平滑肌細胞%血管增殖性疾病
SOCS3%선병독재체%전기인치료%혈관평활기세포%혈관증식성질병
目的 构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定基础.方法 用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ将目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle- 4(带GFP标记)行双酶切.回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态.提取质粒酶切鉴定正确后测序.通过LR体外同源重组将rSOCS3表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上.将腺病毒线性化后转染HEK293细胞包装腺病毒,PCR鉴定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因.放大培养并收集病毒,TCD法测定病毒滴度.将此病毒感染大鼠血管平滑肌细胞,荧光显微镜观察感染效率,real-time PCR及免疫印迹检测SOCS3 mRNA及蛋白表达.结果 rSOCS3腺病毒穿梭质粒酶切鉴定正确,测序与rSOCS3基因库中的序列完全相符.PCR鉴定pAd/PL-DEST腺病毒表达载体成功携带目的基因rSOCS3.TCD法测定的最终滴度为2×1010pfu/mL.荧光显微镜观察此病毒感染血管平滑肌细胞的效率在80％以上,real-time PCR及免疫印迹检测结果显示血管平滑肌细胞中SOCS3 mRNA及蛋白表达明显上调.结论 成功构建携带大鼠SOCS3基因的腺病毒载体,并在血管平滑肌细胞中高表达,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定了基础,具有一定的应用价值.
目的 構建攜帶大鼠SOCS3基因的重組腺病毒載體併轉染大鼠血管平滑肌細胞,評價其轉染效果,為血管增殖性疾病轉基因治療的實驗研究奠定基礎.方法 用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ將目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle- 4(帶GFP標記)行雙酶切.迴收酶切質粒的目的片段進行連接,產物轉化至DH5α感受態.提取質粒酶切鑒定正確後測序.通過LR體外同源重組將rSOCS3錶達框構建至pAd/PL-DEST腺病毒錶達載體上.將腺病毒線性化後轉染HEK293細胞包裝腺病毒,PCR鑒定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因.放大培養併收集病毒,TCD法測定病毒滴度.將此病毒感染大鼠血管平滑肌細胞,熒光顯微鏡觀察感染效率,real-time PCR及免疫印跡檢測SOCS3 mRNA及蛋白錶達.結果 rSOCS3腺病毒穿梭質粒酶切鑒定正確,測序與rSOCS3基因庫中的序列完全相符.PCR鑒定pAd/PL-DEST腺病毒錶達載體成功攜帶目的基因rSOCS3.TCD法測定的最終滴度為2×1010pfu/mL.熒光顯微鏡觀察此病毒感染血管平滑肌細胞的效率在80％以上,real-time PCR及免疫印跡檢測結果顯示血管平滑肌細胞中SOCS3 mRNA及蛋白錶達明顯上調.結論 成功構建攜帶大鼠SOCS3基因的腺病毒載體,併在血管平滑肌細胞中高錶達,為血管增殖性疾病轉基因治療的實驗研究奠定瞭基礎,具有一定的應用價值.
목적 구건휴대대서SOCS3기인적중조선병독재체병전염대서혈관평활기세포,평개기전염효과,위혈관증식성질병전기인치료적실험연구전정기출.방법 용BamH Ⅰ화EcoR Ⅰ장목적기인pUC57-Simple-rSOCS3급선병독천사재체pYr-adshuttle- 4(대GFP표기)행쌍매절.회수매절질립적목적편단진행련접,산물전화지DH5α감수태.제취질립매절감정정학후측서.통과LR체외동원중조장rSOCS3표체광구건지pAd/PL-DEST선병독표체재체상.장선병독선성화후전염HEK293세포포장선병독,PCR감정차선병독중시부함유rSOCS3기인.방대배양병수집병독,TCD법측정병독적도.장차병독감염대서혈관평활기세포,형광현미경관찰감염효솔,real-time PCR급면역인적검측SOCS3 mRNA급단백표체.결과 rSOCS3선병독천사질립매절감정정학,측서여rSOCS3기인고중적서렬완전상부.PCR감정pAd/PL-DEST선병독표체재체성공휴대목적기인rSOCS3.TCD법측정적최종적도위2×1010pfu/mL.형광현미경관찰차병독감염혈관평활기세포적효솔재80％이상,real-time PCR급면역인적검측결과현시혈관평활기세포중SOCS3 mRNA급단백표체명현상조.결론 성공구건휴대대서SOCS3기인적선병독재체,병재혈관평활기세포중고표체,위혈관증식성질병전기인치료적실험연구전정료기출,구유일정적응용개치.
