畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2013年
11期
1797-1804
,共8页
王向鹏%魏蕊芳%肖书奇%周恩民
王嚮鵬%魏蕊芳%肖書奇%週恩民
왕향붕%위예방%초서기%주은민
CD163%慢病毒载体%猪繁殖与呼吸综合征病毒%猪肺泡巨噬细胞
CD163%慢病毒載體%豬繁殖與呼吸綜閤徵病毒%豬肺泡巨噬細胞
CD163%만병독재체%저번식여호흡종합정병독%저폐포거서세포
CD163%lentiviral vector%porcine reproductive and respiratory syndrome virus%porcine alveolar macrophage
本研究旨在通过慢病毒载体系统将猪源CD163转染入永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)系(CRL-2843),建立稳定表达CD163的PAM细胞系(PAM-CD163)及验证该细胞系对PRRSV的易感性.用PCR方法从p JET1.2-CD163载体上扩增CD163基因编码区,通过酶切连接构建慢病毒表达载体pTrip-CMV-CD163-IRES-pur.将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293-T细胞,包装表达CD163的慢病毒.将收获的慢病毒在Polybrene的介导下转导至永生化PAM细胞,采用嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法筛选出稳定表达CD163的PAM细胞系.应用得到的细胞系进行PRRSV感染试验.经过RT-PCR、间接免疫荧光试验、Westernblot和流式细胞术试验证实,筛选出1株能稳定表达CD163的PAM细胞系,命名为PAM-CD163.该株细胞对PRRSV高度易感,PRRSV在PAM-CD163细胞上的毒价可以达到105.0 TCID50·mL-1以上.建立了稳定表达CD163的PAM细胞系,可以用于PRRSV的分离培养和细胞受体的研究.
本研究旨在通過慢病毒載體繫統將豬源CD163轉染入永生化的豬肺泡巨噬細胞(PAM)繫(CRL-2843),建立穩定錶達CD163的PAM細胞繫(PAM-CD163)及驗證該細胞繫對PRRSV的易感性.用PCR方法從p JET1.2-CD163載體上擴增CD163基因編碼區,通過酶切連接構建慢病毒錶達載體pTrip-CMV-CD163-IRES-pur.將該質粒與慢病毒包裝質粒psPAX2和pMD2.G共轉染293-T細胞,包裝錶達CD163的慢病毒.將收穫的慢病毒在Polybrene的介導下轉導至永生化PAM細胞,採用嘌呤黴素篩選和細胞有限稀釋法篩選齣穩定錶達CD163的PAM細胞繫.應用得到的細胞繫進行PRRSV感染試驗.經過RT-PCR、間接免疫熒光試驗、Westernblot和流式細胞術試驗證實,篩選齣1株能穩定錶達CD163的PAM細胞繫,命名為PAM-CD163.該株細胞對PRRSV高度易感,PRRSV在PAM-CD163細胞上的毒價可以達到105.0 TCID50·mL-1以上.建立瞭穩定錶達CD163的PAM細胞繫,可以用于PRRSV的分離培養和細胞受體的研究.
본연구지재통과만병독재체계통장저원CD163전염입영생화적저폐포거서세포(PAM)계(CRL-2843),건립은정표체CD163적PAM세포계(PAM-CD163)급험증해세포계대PRRSV적역감성.용PCR방법종p JET1.2-CD163재체상확증CD163기인편마구,통과매절련접구건만병독표체재체pTrip-CMV-CD163-IRES-pur.장해질립여만병독포장질립psPAX2화pMD2.G공전염293-T세포,포장표체CD163적만병독.장수획적만병독재Polybrene적개도하전도지영생화PAM세포,채용표령매소사선화세포유한희석법사선출은정표체CD163적PAM세포계.응용득도적세포계진행PRRSV감염시험.경과RT-PCR、간접면역형광시험、Westernblot화류식세포술시험증실,사선출1주능은정표체CD163적PAM세포계,명명위PAM-CD163.해주세포대PRRSV고도역감,PRRSV재PAM-CD163세포상적독개가이체도105.0 TCID50·mL-1이상.건립료은정표체CD163적PAM세포계,가이용우PRRSV적분리배양화세포수체적연구.
