中南医学科学杂志
中南醫學科學雜誌
중남의학과학잡지
JOURNAL OF UNIVERSITY OF SOUTH CHINA(MEDICAL EDITION)
2013年
2期
140-145
,共6页
陆丽峰%苏波%姜浩%戴文香%向姝霖%唐海林%凌晖%苏琦
陸麗峰%囌波%薑浩%戴文香%嚮姝霖%唐海林%凌暉%囌琦
륙려봉%소파%강호%대문향%향주림%당해림%릉휘%소기
Chk基因%真核表达%转染%人胃癌MGC803细胞
Chk基因%真覈錶達%轉染%人胃癌MGC803細胞
Chk기인%진핵표체%전염%인위암MGC803세포
目的 构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础. 方法 参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定.用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot 检测表达产物. 结果 菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100％,编码的氨基酸同源性为100％,Chk2基因的同源性为99％,编码的氨基酸同源性为100％.G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞.经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加. 结论 成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础.
目的 構建Chk1/2基因的真覈錶達載體和建立高錶達Chk1/2基因人胃癌MGC803細胞,為研究Chk1/2功能奠定基礎. 方法 參照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA兩耑各設計一條對應引物,併引入各自的酶切位點.從人胃癌MGC803細胞中提取mRNA作為模闆閤成Chk1/2 cDNA第一鏈,併擴增目的基因全錶達序列片斷,雙酶切後定嚮剋隆至pcDNA3.1(+)真覈錶達載體,經氨芐青黴素篩選暘性重組質粒,菌液PCR及測序法對重組質粒進行鑒定.用脂質體將重組質粒轉染入MGC803細胞,經G418篩選後,RT-PCR及Western blot 檢測錶達產物. 結果 菌液特異性PCR結果錶明剋隆的基因片斷分彆為1.4 kb和1.6 kb,測序分彆證實為Chk1和Chk2基因,經NCBIBLAST分析與Genbank中Chk1基因的同源性為100％,編碼的氨基痠同源性為100％,Chk2基因的同源性為99％,編碼的氨基痠同源性為100％.G418篩選轉染細胞4週後穫得穩定轉染空載體pcDNA3.1(+)的細胞剋隆株和穩定轉染重組質粒的MGC803細胞.經RT-PCR及Western blot鑒定,Chk1/2在MGC803細胞中的錶達比對照組明顯增加. 結論 成功構建Chk1/2基因真覈錶達載體與Chk1/2高錶達MGC803細胞,為研究二烯丙基二硫誘導MGC803細胞G2/M期阻滯的機製奠定瞭基礎.
목적 구건Chk1/2기인적진핵표체재체화건립고표체Chk1/2기인인위암MGC803세포,위연구Chk1/2공능전정기출. 방법 삼조야생형Chk1/2기인mRNA전서렬,재cDNA량단각설계일조대응인물,병인입각자적매절위점.종인위암MGC803세포중제취mRNA작위모판합성Chk1/2 cDNA제일련,병확증목적기인전표체서렬편단,쌍매절후정향극륭지pcDNA3.1(+)진핵표체재체,경안변청매소사선양성중조질립,균액PCR급측서법대중조질립진행감정.용지질체장중조질립전염입MGC803세포,경G418사선후,RT-PCR급Western blot 검측표체산물. 결과 균액특이성PCR결과표명극륭적기인편단분별위1.4 kb화1.6 kb,측서분별증실위Chk1화Chk2기인,경NCBIBLAST분석여Genbank중Chk1기인적동원성위100％,편마적안기산동원성위100％,Chk2기인적동원성위99％,편마적안기산동원성위100％.G418사선전염세포4주후획득은정전염공재체pcDNA3.1(+)적세포극륭주화은정전염중조질립적MGC803세포.경RT-PCR급Western blot감정,Chk1/2재MGC803세포중적표체비대조조명현증가. 결론 성공구건Chk1/2기인진핵표체재체여Chk1/2고표체MGC803세포,위연구이희병기이류유도MGC803세포G2/M기조체적궤제전정료기출.
