农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2013年
4期
441-447
,共7页
应慧慧%余海鹏%寿鑫%全滟平%张耀洲%童富淡%于威
應慧慧%餘海鵬%壽鑫%全滟平%張耀洲%童富淡%于威
응혜혜%여해붕%수흠%전염평%장요주%동부담%우위
家蚕%Bm30Kc6%细胞凋亡%抑制作用
傢蠶%Bm30Kc6%細胞凋亡%抑製作用
가잠%Bm30Kc6%세포조망%억제작용
30K蛋白是一类家蚕(Bombyx mori)血淋巴中具有最强抗细胞凋亡活性的蛋白,家蚕Bm30Kc6蛋白作为30K蛋白家族的成员之一,也具有较强的抗细胞凋亡作用,但其抗细胞凋亡的作用机制还不十分清楚.本研究将本实验室成功构建的重组病毒Bacmid-Bm30Kc6接种家蚕BmN细胞大量表达后,利用Ni-NTA蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白Bm30Kc6.SDS-PAGE和Western blot检测结果显示纯化蛋白的纯度较高.然后利用不同浓度(0.1、1、5和10 mmol/L)的H2O2处理家蚕BmN细胞,诱导细胞发生凋亡,结果表明,在培养基中加入终浓度为5 mmol/LH2O2孵育4h后即可成功诱导BmN细胞凋亡.在上述建立的H2O2诱导的家蚕BmN细胞凋亡体外损伤模型的基础上,分析了Bm30Kc6蛋白的抗细胞凋亡的活性及作用机制.首先利用Cell death Detection ELISA试剂盒检测了细胞内的DNA片段化程度,检测结果表明,Bm30Kc6蛋白(终浓度5μg/mL)可明显降低H2O2诱导的家蚕BmN细胞内的DNA片段化程度.然后利用Cell proliferation ELISA试剂盒检测了细胞的增殖情况,结果表明,Bm30Kc6蛋白可以显著增强家蚕BmN细胞的活力.进一步利用8-isoprostane EIA试剂盒检测细胞内氧化应激标志物8-isoprostane的浓度变化,结果显示,家蚕Bm30Kc6蛋白可以显著降低胞内8-isoprostane的浓度.此外,Western blot分析结果显示,Bm30Kc6蛋白可显著抑制家蚕BmN细胞中细胞色素c从线粒体中释放进入细胞质.Bm30Kc6蛋白一方面可以通过降低BmN细胞内的氧化应激水平从而起到抑制细胞凋亡的作用；另一方面,Bm30Kc6蛋白也可以通过阻断H2O2诱导激活的线粒体通路来抑制细胞发生凋亡.本研究将为进一步深入研究家蚕Bm30Kc6蛋白的抗凋亡机制提供基础资料.
30K蛋白是一類傢蠶(Bombyx mori)血淋巴中具有最彊抗細胞凋亡活性的蛋白,傢蠶Bm30Kc6蛋白作為30K蛋白傢族的成員之一,也具有較彊的抗細胞凋亡作用,但其抗細胞凋亡的作用機製還不十分清楚.本研究將本實驗室成功構建的重組病毒Bacmid-Bm30Kc6接種傢蠶BmN細胞大量錶達後,利用Ni-NTA蛋白親和層析柱純化重組蛋白Bm30Kc6.SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示純化蛋白的純度較高.然後利用不同濃度(0.1、1、5和10 mmol/L)的H2O2處理傢蠶BmN細胞,誘導細胞髮生凋亡,結果錶明,在培養基中加入終濃度為5 mmol/LH2O2孵育4h後即可成功誘導BmN細胞凋亡.在上述建立的H2O2誘導的傢蠶BmN細胞凋亡體外損傷模型的基礎上,分析瞭Bm30Kc6蛋白的抗細胞凋亡的活性及作用機製.首先利用Cell death Detection ELISA試劑盒檢測瞭細胞內的DNA片段化程度,檢測結果錶明,Bm30Kc6蛋白(終濃度5μg/mL)可明顯降低H2O2誘導的傢蠶BmN細胞內的DNA片段化程度.然後利用Cell proliferation ELISA試劑盒檢測瞭細胞的增殖情況,結果錶明,Bm30Kc6蛋白可以顯著增彊傢蠶BmN細胞的活力.進一步利用8-isoprostane EIA試劑盒檢測細胞內氧化應激標誌物8-isoprostane的濃度變化,結果顯示,傢蠶Bm30Kc6蛋白可以顯著降低胞內8-isoprostane的濃度.此外,Western blot分析結果顯示,Bm30Kc6蛋白可顯著抑製傢蠶BmN細胞中細胞色素c從線粒體中釋放進入細胞質.Bm30Kc6蛋白一方麵可以通過降低BmN細胞內的氧化應激水平從而起到抑製細胞凋亡的作用；另一方麵,Bm30Kc6蛋白也可以通過阻斷H2O2誘導激活的線粒體通路來抑製細胞髮生凋亡.本研究將為進一步深入研究傢蠶Bm30Kc6蛋白的抗凋亡機製提供基礎資料.
30K단백시일류가잠(Bombyx mori)혈림파중구유최강항세포조망활성적단백,가잠Bm30Kc6단백작위30K단백가족적성원지일,야구유교강적항세포조망작용,단기항세포조망적작용궤제환불십분청초.본연구장본실험실성공구건적중조병독Bacmid-Bm30Kc6접충가잠BmN세포대량표체후,이용Ni-NTA단백친화층석주순화중조단백Bm30Kc6.SDS-PAGE화Western blot검측결과현시순화단백적순도교고.연후이용불동농도(0.1、1、5화10 mmol/L)적H2O2처리가잠BmN세포,유도세포발생조망,결과표명,재배양기중가입종농도위5 mmol/LH2O2부육4h후즉가성공유도BmN세포조망.재상술건립적H2O2유도적가잠BmN세포조망체외손상모형적기출상,분석료Bm30Kc6단백적항세포조망적활성급작용궤제.수선이용Cell death Detection ELISA시제합검측료세포내적DNA편단화정도,검측결과표명,Bm30Kc6단백(종농도5μg/mL)가명현강저H2O2유도적가잠BmN세포내적DNA편단화정도.연후이용Cell proliferation ELISA시제합검측료세포적증식정황,결과표명,Bm30Kc6단백가이현저증강가잠BmN세포적활력.진일보이용8-isoprostane EIA시제합검측세포내양화응격표지물8-isoprostane적농도변화,결과현시,가잠Bm30Kc6단백가이현저강저포내8-isoprostane적농도.차외,Western blot분석결과현시,Bm30Kc6단백가현저억제가잠BmN세포중세포색소c종선립체중석방진입세포질.Bm30Kc6단백일방면가이통과강저BmN세포내적양화응격수평종이기도억제세포조망적작용；령일방면,Bm30Kc6단백야가이통과조단H2O2유도격활적선립체통로래억제세포발생조망.본연구장위진일보심입연구가잠Bm30Kc6단백적항조망궤제제공기출자료.
