组织工程与重建外科杂志
組織工程與重建外科雜誌
조직공정여중건외과잡지
JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING AND RECONSTRUCTIVE SURGERY
2012年
6期
301-304
,共4页
曹小芳%王恒湘%何梓铭%王芳%杨洋%郭子宽
曹小芳%王恆湘%何梓銘%王芳%楊洋%郭子寬
조소방%왕항상%하재명%왕방%양양%곽자관
高迁移率族B1 A-box%间充质干细胞%成骨细胞
高遷移率族B1 A-box%間充質榦細胞%成骨細胞
고천이솔족B1 A-box%간충질간세포%성골세포
目的 克隆人HMGB1 A-box的cDNA,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株并对其诱导表达纯化,同时探讨其对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的促分化作用.方法 根据优选合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段,插入克隆载体pGEM-T并进行序列测定.重组克隆载体经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入含His标签的表达载体pET24a.将构建的质粒转染BL21大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE观察表达量.HIS-link层析柱纯化重组人HMGB1 A-box,蛋白印迹鉴定重组蛋白.将重组蛋白加入hBMSC培养体系中培养一周后,碱性磷酸酶染色检测其促MSC成骨分化作用.结果 经RT-PCR扩增得到了261 bp的DNA片段,经测序分析,与GenBank中报道的已知序列完全一致,构建了含融合蛋白的重组表达质粒.经诱导后细菌高表达A-box,表达量为总蛋白的45％.经层析柱纯化后,蛋白印迹证实目的蛋白为高纯度的A-box.将A-box加入MSC培养体系中培养后,细胞活性无明显改变,但细胞碱性磷酸酶表达明显增高.结论 成功构建了重组人HMGB1 A-Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效促进MSC向成骨细胞分化.
目的 剋隆人HMGB1 A-box的cDNA,構建高效穩定的大腸桿菌(E.coli)錶達菌株併對其誘導錶達純化,同時探討其對間充質榦細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的促分化作用.方法 根據優選閤成的HMGB1基因序列設計引物,PCR擴增目的基因片段,插入剋隆載體pGEM-T併進行序列測定.重組剋隆載體經BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切,瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因,插入含His標籤的錶達載體pET24a.將構建的質粒轉染BL21大腸桿菌,經IPTG誘導後,SDS-PAGE觀察錶達量.HIS-link層析柱純化重組人HMGB1 A-box,蛋白印跡鑒定重組蛋白.將重組蛋白加入hBMSC培養體繫中培養一週後,堿性燐痠酶染色檢測其促MSC成骨分化作用.結果 經RT-PCR擴增得到瞭261 bp的DNA片段,經測序分析,與GenBank中報道的已知序列完全一緻,構建瞭含融閤蛋白的重組錶達質粒.經誘導後細菌高錶達A-box,錶達量為總蛋白的45％.經層析柱純化後,蛋白印跡證實目的蛋白為高純度的A-box.將A-box加入MSC培養體繫中培養後,細胞活性無明顯改變,但細胞堿性燐痠酶錶達明顯增高.結論 成功構建瞭重組人HMGB1 A-Box的錶達載體,純化的重組蛋白能有效促進MSC嚮成骨細胞分化.
목적 극륭인HMGB1 A-box적cDNA,구건고효은정적대장간균(E.coli)표체균주병대기유도표체순화,동시탐토기대간충질간세포(Mesenchymal stem cells,MSC)적촉분화작용.방법 근거우선합성적HMGB1기인서렬설계인물,PCR확증목적기인편단,삽입극륭재체pGEM-T병진행서렬측정.중조극륭재체경BamH Ⅰ화Xho Ⅰ매절,경지당응효전영분리목적기인,삽입함His표첨적표체재체pET24a.장구건적질립전염BL21대장간균,경IPTG유도후,SDS-PAGE관찰표체량.HIS-link층석주순화중조인HMGB1 A-box,단백인적감정중조단백.장중조단백가입hBMSC배양체계중배양일주후,감성린산매염색검측기촉MSC성골분화작용.결과 경RT-PCR확증득도료261 bp적DNA편단,경측서분석,여GenBank중보도적이지서렬완전일치,구건료함융합단백적중조표체질립.경유도후세균고표체A-box,표체량위총단백적45％.경층석주순화후,단백인적증실목적단백위고순도적A-box.장A-box가입MSC배양체계중배양후,세포활성무명현개변,단세포감성린산매표체명현증고.결론 성공구건료중조인HMGB1 A-Box적표체재체,순화적중조단백능유효촉진MSC향성골세포분화.
