温州医学院学报
溫州醫學院學報
온주의학원학보
JOURNAL OF WENZHOU MEDICAL COLLEGE
2013年
1期
9-14
,共6页
林素%黄晓燕%王本极%潘嘉林%王良国%杨德业
林素%黃曉燕%王本極%潘嘉林%王良國%楊德業
림소%황효연%왕본겁%반가림%왕량국%양덕업
真核表达载体%成纤维细胞生长因子6%基因%肌细胞,心脏%细胞增殖%细胞凋亡%小鼠%大鼠
真覈錶達載體%成纖維細胞生長因子6%基因%肌細胞,心髒%細胞增殖%細胞凋亡%小鼠%大鼠
진핵표체재체%성섬유세포생장인자6%기인%기세포,심장%세포증식%세포조망%소서%대서
目的:克隆小鼠成纤维细胞生长因子6 (FGF6)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带FGF6基因的重组真核表达载体,并将重组质粒转染至心肌细胞系H9C2细胞中进行表达,测定转染后FGF6基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响.方法:从小鼠心脏组织提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒PIRES2-DsRed2.以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体PIRES2-DsRed2-FGF6用脂质体包裹转染大鼠心肌细胞(H9C2),分组:空白对照(BC)组、转染空质粒(NC)组、转染重组FGF6-PIRES2-DsRed2质粒(P-FGF6)组,RT-PCR法检测转染后FGF6 mRNA表达水平,荧光显微镜观察转染效率.Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测转染后细胞的增殖能力；以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行FGF6质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blot方法检测活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达.结果:成功克隆了小鼠FGF6基因cDNA,重组真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6构建成功,且证实转染后大鼠心肌细胞的FGF6mRNA表达明显高于BC组(P＜0.05)及NC组(P＜0.05),转染FGF6基因能提高心肌细胞的增殖能力(P＜0.05),FGF6基因能明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P＜ 0.05),同时下调活化caspase-3表达(P＜0.05).结论:成功克隆了FGF6基因,并构建了真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6,重组FGF6真核表达载体能够在H9C2细胞中获得有效过表达,并证实FGF6基因可促进心肌细胞的增殖及保护心肌细胞的凋亡.
目的:剋隆小鼠成纖維細胞生長因子6 (FGF6)基因cDNA的讀碼框(CDS),構建攜帶FGF6基因的重組真覈錶達載體,併將重組質粒轉染至心肌細胞繫H9C2細胞中進行錶達,測定轉染後FGF6基因對心肌細胞增殖及凋亡的影響.方法:從小鼠心髒組織提取總RNA,通過逆轉錄得到總cDNA,PCR法擴增,產物連接pGEM-T Easy載體測序分析正確後,再以PCR方法擴增,將其連接入真覈錶達質粒PIRES2-DsRed2.以PCR、雙酶切和測序鑒定正確後,將重組載體PIRES2-DsRed2-FGF6用脂質體包裹轉染大鼠心肌細胞(H9C2),分組:空白對照(BC)組、轉染空質粒(NC)組、轉染重組FGF6-PIRES2-DsRed2質粒(P-FGF6)組,RT-PCR法檢測轉染後FGF6 mRNA錶達水平,熒光顯微鏡觀察轉染效率.Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測轉染後細胞的增殖能力；以血清饑餓誘導心肌細胞凋亡,同時進行FGF6質粒轉染,流式細胞儀檢測細胞凋亡指數,Western blot方法檢測活化半胱氨痠蛋白酶3(caspase-3)錶達.結果:成功剋隆瞭小鼠FGF6基因cDNA,重組真覈錶達載體PIRES2-DsRed2-FGF6構建成功,且證實轉染後大鼠心肌細胞的FGF6mRNA錶達明顯高于BC組(P＜0.05)及NC組(P＜0.05),轉染FGF6基因能提高心肌細胞的增殖能力(P＜0.05),FGF6基因能明顯抑製血清饑餓引起的細胞凋亡(P＜ 0.05),同時下調活化caspase-3錶達(P＜0.05).結論:成功剋隆瞭FGF6基因,併構建瞭真覈錶達載體PIRES2-DsRed2-FGF6,重組FGF6真覈錶達載體能夠在H9C2細胞中穫得有效過錶達,併證實FGF6基因可促進心肌細胞的增殖及保護心肌細胞的凋亡.
목적:극륭소서성섬유세포생장인자6 (FGF6)기인cDNA적독마광(CDS),구건휴대FGF6기인적중조진핵표체재체,병장중조질립전염지심기세포계H9C2세포중진행표체,측정전염후FGF6기인대심기세포증식급조망적영향.방법:종소서심장조직제취총RNA,통과역전록득도총cDNA,PCR법확증,산물련접pGEM-T Easy재체측서분석정학후,재이PCR방법확증,장기련접입진핵표체질립PIRES2-DsRed2.이PCR、쌍매절화측서감정정학후,장중조재체PIRES2-DsRed2-FGF6용지질체포과전염대서심기세포(H9C2),분조:공백대조(BC)조、전염공질립(NC)조、전염중조FGF6-PIRES2-DsRed2질립(P-FGF6)조,RT-PCR법검측전염후FGF6 mRNA표체수평,형광현미경관찰전염효솔.Cell Counting Kit-8(CCK-8)법검측전염후세포적증식능력；이혈청기아유도심기세포조망,동시진행FGF6질립전염,류식세포의검측세포조망지수,Western blot방법검측활화반광안산단백매3(caspase-3)표체.결과:성공극륭료소서FGF6기인cDNA,중조진핵표체재체PIRES2-DsRed2-FGF6구건성공,차증실전염후대서심기세포적FGF6mRNA표체명현고우BC조(P＜0.05)급NC조(P＜0.05),전염FGF6기인능제고심기세포적증식능력(P＜0.05),FGF6기인능명현억제혈청기아인기적세포조망(P＜ 0.05),동시하조활화caspase-3표체(P＜0.05).결론:성공극륭료FGF6기인,병구건료진핵표체재체PIRES2-DsRed2-FGF6,중조FGF6진핵표체재체능구재H9C2세포중획득유효과표체,병증실FGF6기인가촉진심기세포적증식급보호심기세포적조망.
