CAJ | 학술논문

目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系.方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列.以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒.以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系.将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系.结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列.免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系.相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P＜0.01.结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型.该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系.
목적 이용역병독표체재체쾌속구건제도과표체인MTA1은전단극륭세포계.방법 이용서균반원위잡교사선인폐서균체문고,이양성극륭위모판,RT-PCR획득인MTA1완정CDS서렬.이역병독표체재체pMX위기출,경과다차매절련접,구건역병독표체재체pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.장구건호적역병독재체계통,전염293-gag/pol세포,포장출함해표체재체적역병독과립.이함병독상청다차감염HCT116세포,획득은정전염MTA1적HCT116다극륭세포계.장해다극륭세포계안합괄비례희석후접충지10cm대명,획득대량단극륭세포계,이GFP위사선표지,사선불동형광강도적단세포극륭진행확증병분석MTA1여GFP표체수평적선성관계.결과 측서결과현시성공극륭출인MTA1표체서렬.면역형광、Western Blot결과증실성공구건출제도과표체MTA1적은전세포계.상관성험증결과현시구건적비융합재체MTA1여GFP적표체정명현적선성상관,상관계수r=0.932,P＜0.01.결론 이용역병독표체계통,쾌속성공구건병사선출MTA1여GFP비융합제도과표체은전단극륭세포계,위MTA1기인공능연구제공료량호모형.해역전록병독평태가용우쾌속건립기타기인적은전단극륭세포계.