中国畜牧杂志
中國畜牧雜誌
중국축목잡지
CHINESE JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE
2014年
9期
78-82
,共5页
伏彭辉%王一帆%王玲%罗宗刚
伏彭輝%王一帆%王玲%囉宗剛
복팽휘%왕일범%왕령%라종강
穿膜肽%TAT%NLS%原核表达
穿膜肽%TAT%NLS%原覈錶達
천막태%TAT%NLS%원핵표체
cell-penetrating peptide%TAT%nuclear localization signal%prokaryotic expression
为进一步建立蛋白诱导水牛iPS细胞体系,本实验对穿膜肽TAT与标记蛋白EGFP进行融合表达,同时引入核定位NLS序列,获得纯化蛋白后进行细胞共培养试验,以探讨穿膜肽TAT对携带水牛干细胞转录因子纯化蛋白进入细胞内的效果.首先通过PCR扩增、TA克隆、双酶切以及T4连接等步骤构建原核表达载体pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT;再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达;然后用HisTrap HP层析柱纯化融合蛋白,经复性、透析和浓缩后,最后将纯化的EGFP蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白分别添加到水牛成纤维细胞中共培养.结果表明:成功表达了融合蛋白EGFP(47.3 ku)和NLS-EGFP-TAT(50.1 ku);纯化蛋白与水牛成纤维细胞共培养5～8 h后,EGFP蛋白不能进入细胞内,而NLS-EGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的帮助下能够顺利进入细胞内,但未能显著定位到细胞核内.
為進一步建立蛋白誘導水牛iPS細胞體繫,本實驗對穿膜肽TAT與標記蛋白EGFP進行融閤錶達,同時引入覈定位NLS序列,穫得純化蛋白後進行細胞共培養試驗,以探討穿膜肽TAT對攜帶水牛榦細胞轉錄因子純化蛋白進入細胞內的效果.首先通過PCR擴增、TA剋隆、雙酶切以及T4連接等步驟構建原覈錶達載體pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT;再將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導,用SDS-PAGE電泳檢測融閤蛋白錶達;然後用HisTrap HP層析柱純化融閤蛋白,經複性、透析和濃縮後,最後將純化的EGFP蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白分彆添加到水牛成纖維細胞中共培養.結果錶明:成功錶達瞭融閤蛋白EGFP(47.3 ku)和NLS-EGFP-TAT(50.1 ku);純化蛋白與水牛成纖維細胞共培養5～8 h後,EGFP蛋白不能進入細胞內,而NLS-EGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的幫助下能夠順利進入細胞內,但未能顯著定位到細胞覈內.
위진일보건립단백유도수우iPS세포체계,본실험대천막태TAT여표기단백EGFP진행융합표체,동시인입핵정위NLS서렬,획득순화단백후진행세포공배양시험,이탐토천막태TAT대휴대수우간세포전록인자순화단백진입세포내적효과.수선통과PCR확증、TA극륭、쌍매절이급T4련접등보취구건원핵표체재체pET-EGFP화pET-NLS-EGFP-TAT;재장중조질립전화대장간균BL21(DE3),경IPTG유도,용SDS-PAGE전영검측융합단백표체;연후용HisTrap HP층석주순화융합단백,경복성、투석화농축후,최후장순화적EGFP단백화NLS-EGFP-TAT단백분별첨가도수우성섬유세포중공배양.결과표명:성공표체료융합단백EGFP(47.3 ku)화NLS-EGFP-TAT(50.1 ku);순화단백여수우성섬유세포공배양5～8 h후,EGFP단백불능진입세포내,이NLS-EGFP-TAT단백재천막태TAT적방조하능구순리진입세포내,단미능현저정위도세포핵내.
