南昌大学学报（医学版）
南昌大學學報（醫學版）
남창대학학보（의학판）
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE JIANGXI
2013年
12期
7-10,15
,共5页
李维中%王月明%吴莹莹%邬玉兰%刘志刚
李維中%王月明%吳瑩瑩%鄔玉蘭%劉誌剛
리유중%왕월명%오형형%오옥란%류지강
粉尘螨%Derf16%克隆%表达%纯化
粉塵螨%Derf16%剋隆%錶達%純化
분진만%Derf16%극륭%표체%순화
目的 获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原(Der f16)的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究.方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中.扩增后,利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切将目的 基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌(E.coli BL21)中经IPTG诱导表达.表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性.结果 以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73 ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物.重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE 反应,而不与健康者血清中的IgE反应.结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白.
目的 穫得大量具有良好IgE結閤活性的粉塵螨第十六類變應原(Der f16)的重組變應原,以促進粉塵螨變態反應性疾病的特異性診斷及治療的研究.方法 挑取經純培養的粉塵螨,提取總RNA,根據已知Der f16基因序列設計引物,經RT-PCR擴增Der f16基因片段,產物連入pMD32-T載體中.擴增後,利用限製性內切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切將目的 基因片段連接到pET32a錶達載體上,轉化到大腸桿菌(E.coli BL21)中經IPTG誘導錶達.錶達載體經親和層析純化,SDS-PAGE檢測蛋白純度,Western bolt檢測變應原免疫學活性.結果 以粉塵螨總RNA為模闆成功剋隆齣Der f16基因,與數據庫中Der f16基因同源性為100%;經IPTG誘導後,大腸桿菌大量錶達Der f16蛋白,所穫得的重組蛋白分子質量為73 ku,上清及沉澱物均有蛋白錶達,且上清錶達量高于沉澱物.重組Der f16能夠與螨過敏患者血清中的IgE 反應,而不與健康者血清中的IgE反應.結論成功構建瞭Der f16的原覈錶達載體,併高效錶達和純化齣具有免疫原性的Der f16重組蛋白.
목적 획득대량구유량호IgE결합활성적분진만제십륙류변응원(Der f16)적중조변응원,이촉진분진만변태반응성질병적특이성진단급치료적연구.방법 도취경순배양적분진만,제취총RNA,근거이지Der f16기인서렬설계인물,경RT-PCR확증Der f16기인편단,산물련입pMD32-T재체중.확증후,이용한제성내절매EcoR Ⅰ화XhoⅠ쌍매절장목적 기인편단련접도pET32a표체재체상,전화도대장간균(E.coli BL21)중경IPTG유도표체.표체재체경친화층석순화,SDS-PAGE검측단백순도,Western bolt검측변응원면역학활성.결과 이분진만총RNA위모판성공극륭출Der f16기인,여수거고중Der f16기인동원성위100%;경IPTG유도후,대장간균대량표체Der f16단백,소획득적중조단백분자질량위73 ku,상청급침정물균유단백표체,차상청표체량고우침정물.중조Der f16능구여만과민환자혈청중적IgE 반응,이불여건강자혈청중적IgE반응.결론성공구건료Der f16적원핵표체재체,병고효표체화순화출구유면역원성적Der f16중조단백.
