微生物学杂志
微生物學雜誌
미생물학잡지
JOURNAL OF MICROBIOLOGY
2014年
3期
30-35
,共6页
秦江楠%毕春霞%陈秀琴%罗玮%张卫%任莹%王斌%闫志勇
秦江楠%畢春霞%陳秀琴%囉瑋%張衛%任瑩%王斌%閆誌勇
진강남%필춘하%진수금%라위%장위%임형%왕빈%염지용
嗜麦芽寡养单胞菌%自杀质粒%同源重组%基因敲除
嗜麥芽寡養單胞菌%自殺質粒%同源重組%基因敲除
기맥아과양단포균%자살질립%동원중조%기인고제
Stenotrophomonas maltophilia%suicide plasmid%homologous recombination%gene knockout
为深入研究smp基因的功能,需构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株.首先,PCR扩增D2株smp基因上游、下游片段作为上下游同源臂,同时扩增获得氯霉素抗性(cat)基因,采用SOE-PCR方法将各片段连接,然后双酶切后克隆入自杀质粒pEX18Tc,构建获得重组自杀质粒pEX18Tc-△smp/cat,并转化入大肠埃希菌SM10λpir.通过接合将重组自杀质粒转入嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株,经同源重组以cat基因替换野生株的smp基因,链霉素和氯霉素双抗培养基筛选接合子,15％蔗糖选择培养基筛选smp基因缺失株.PCR、酶切和测序验证重组自杀质粒pEX18Tc-△smp/cat构建正确,缺失株的分泌蛋白经12％ SDS-PAGE证实嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株失去表达SMP蛋白的能力.结果显示成功获得smp基因缺失的嗜麦芽寡养单胞菌D2株,为进一步研究其功能和胞外分泌途径奠定基础.
為深入研究smp基因的功能,需構建嗜麥芽寡養單胞菌D2株smp基因缺失株.首先,PCR擴增D2株smp基因上遊、下遊片段作為上下遊同源臂,同時擴增穫得氯黴素抗性(cat)基因,採用SOE-PCR方法將各片段連接,然後雙酶切後剋隆入自殺質粒pEX18Tc,構建穫得重組自殺質粒pEX18Tc-△smp/cat,併轉化入大腸埃希菌SM10λpir.通過接閤將重組自殺質粒轉入嗜麥芽寡養單胞菌D2野生株,經同源重組以cat基因替換野生株的smp基因,鏈黴素和氯黴素雙抗培養基篩選接閤子,15％蔗糖選擇培養基篩選smp基因缺失株.PCR、酶切和測序驗證重組自殺質粒pEX18Tc-△smp/cat構建正確,缺失株的分泌蛋白經12％ SDS-PAGE證實嗜麥芽寡養單胞菌D2株smp基因缺失株失去錶達SMP蛋白的能力.結果顯示成功穫得smp基因缺失的嗜麥芽寡養單胞菌D2株,為進一步研究其功能和胞外分泌途徑奠定基礎.
위심입연구smp기인적공능,수구건기맥아과양단포균D2주smp기인결실주.수선,PCR확증D2주smp기인상유、하유편단작위상하유동원비,동시확증획득록매소항성(cat)기인,채용SOE-PCR방법장각편단련접,연후쌍매절후극륭입자살질립pEX18Tc,구건획득중조자살질립pEX18Tc-△smp/cat,병전화입대장애희균SM10λpir.통과접합장중조자살질립전입기맥아과양단포균D2야생주,경동원중조이cat기인체환야생주적smp기인,련매소화록매소쌍항배양기사선접합자,15％자당선택배양기사선smp기인결실주.PCR、매절화측서험증중조자살질립pEX18Tc-△smp/cat구건정학,결실주적분비단백경12％ SDS-PAGE증실기맥아과양단포균D2주smp기인결실주실거표체SMP단백적능력.결과현시성공획득smp기인결실적기맥아과양단포균D2주,위진일보연구기공능화포외분비도경전정기출.
