中国免疫学杂志
中國免疫學雜誌
중국면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF IMMUNOLOGY
2014年
4期
499-504
,共6页
楚荷莹%常静侠%赵国强%张国俊
楚荷瑩%常靜俠%趙國彊%張國俊
초하형%상정협%조국강%장국준
肺腺癌%神经元表达发育下调基因9%RNA干扰%A549
肺腺癌%神經元錶達髮育下調基因9%RNA榦擾%A549
폐선암%신경원표체발육하조기인9%RNA간우%A549
Adenocarcinoma%NEDD9%RNA interference%A549 cell
目的:构建针对神经元表达发育下调基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对A549肺腺癌细胞株中NEDD9表达的抑制作用.方法:根据GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)核苷酸序列及siRNA的设计原则,筛选得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列;分别合成4对带有BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入载体pRNAT-CMV3.2中构建重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.用脂质体介导转染入A549肺腺癌细胞株,采用QRT-PCR和Western blot方法检测细胞NEDD9基因mRNA和蛋白表达.结果:PCR筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低A549细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达.结论:成功构建载体介导的NEDD9靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制A549细胞中NEDD9基因的表达.
目的:構建針對神經元錶達髮育下調基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小榦擾RNA(siRNA)錶達載體,研究載體介導的RNAi技術對A549肺腺癌細胞株中NEDD9錶達的抑製作用.方法:根據GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)覈苷痠序列及siRNA的設計原則,篩選得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3箇19 bp片段靶序列,同時隨機組閤齣一條無關序列;分彆閤成4對帶有BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位點的髮夾結構寡覈苷痠序列,經退火閤成互補DNA雙鏈,剋隆入載體pRNAT-CMV3.2中構建重組錶達載體,轉化DH5α,提取質粒,應用PCR技術和測序方法鑒定重組剋隆.用脂質體介導轉染入A549肺腺癌細胞株,採用QRT-PCR和Western blot方法檢測細胞NEDD9基因mRNA和蛋白錶達.結果:PCR篩選得到4箇目的片段的暘性剋隆,測序證實重組錶達載體中插入序列與設計一緻.RT-PCR和Western blot檢測顯示構建的siRNA錶達載體可顯著降低A549細胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的錶達.結論:成功構建載體介導的NEDD9靶嚮RNA榦擾重組體,併能有效抑製A549細胞中NEDD9基因的錶達.
목적:구건침대신경원표체발육하조기인9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)적소간우RNA(siRNA)표체재체,연구재체개도적RNAi기술대A549폐선암세포주중NEDD9표체적억제작용.방법:근거GenBank제공적NEDD9기인(NM_182966)핵감산서렬급siRNA적설계원칙,사선득도159-177 nt、193-211 nt화648-666 nt 3개19 bp편단파서렬,동시수궤조합출일조무관서렬;분별합성4대대유BamH Ⅰ、Xho Ⅰ매절위점적발협결구과핵감산서렬,경퇴화합성호보DNA쌍련,극륭입재체pRNAT-CMV3.2중구건중조표체재체,전화DH5α,제취질립,응용PCR기술화측서방법감정중조극륭.용지질체개도전염입A549폐선암세포주,채용QRT-PCR화Western blot방법검측세포NEDD9기인mRNA화단백표체.결과:PCR사선득도4개목적편단적양성극륭,측서증실중조표체재체중삽입서렬여설계일치.RT-PCR화Western blot검측현시구건적siRNA표체재체가현저강저A549세포중NEDD9 mRNA화단백수평적표체.결론:성공구건재체개도적NEDD9파향RNA간우중조체,병능유효억제A549세포중NEDD9기인적표체.
