武警医学
武警醫學
무경의학
MEDICAL JOURNAL OF THE CHINESE PEOPLE'S ARMED POLICE FORCES
2013年
12期
1047-1052
,共6页
姚琦%张立才%倪杰%侯宇%刘长振%郁卫东%张里程
姚琦%張立纔%倪傑%侯宇%劉長振%鬱衛東%張裏程
요기%장립재%예걸%후우%류장진%욱위동%장리정
骨硬化素%单链抗体%骨质疏松%表达%活性
骨硬化素%單鏈抗體%骨質疏鬆%錶達%活性
골경화소%단련항체%골질소송%표체%활성
目的 构建抗Sclerostin(SOST)单链抗体原核表达载体并对表达蛋白进行活性分析.方法 提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体轻链可变区基因(VL)和重链可变区基因(VH)并通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VL和VH基因之间引入Linker(Gly4Ser)3,连接成单链抗体SOST-scFv(VL-Linker VH).将scFv基因克隆至表达载体PET-22b(+)后转入HEK293细胞进行分泌表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性,茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响.结果 VL基因序列全长为339个碱基对,VH基因序列全长330个碱基对,均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,而SOST-scFv基因全长包括4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)以及具有抗体特征性的2个半胱氨酸残基;本研究构建的scFv全长687个碱基对,VL-Linker-VH为连接结构,SDS-PAGE分析表明大肠杆菌表达的scFv为可溶性蛋白,ELISA和West-blot检测证实表达scFv具有与SOST特异性结合的活性,细胞实验结果证实scFv能够促进骨髓间充质细胞成骨分化及矿化结节的形成.结论 成功构建抗SOST单链抗体表达载体,而且表达的scFv产物具有确切的免疫结合活性以及体外诱导成骨分化、矿化作用,为该抗体应用于骨质疏松疾病治疗奠定了实验基础.
目的 構建抗Sclerostin(SOST)單鏈抗體原覈錶達載體併對錶達蛋白進行活性分析.方法 提取抗SOST單剋隆抗體5H3D1雜交瘤細胞總RNA,用RT-PCR方法擴增抗體輕鏈可變區基因(VL)和重鏈可變區基因(VH)併通過重疊延伸拼接(SOE)PCR方法,在VL和VH基因之間引入Linker(Gly4Ser)3,連接成單鏈抗體SOST-scFv(VL-Linker VH).將scFv基因剋隆至錶達載體PET-22b(+)後轉入HEK293細胞進行分泌錶達,聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE鑒定錶達產物,ELISA和West-blot檢測錶達蛋白的反應活性,茜素紅結節染色法評估單鏈抗體對體外培養骨髓間充質榦細胞成骨礦化的影響.結果 VL基因序列全長為339箇堿基對,VH基因序列全長330箇堿基對,均符閤小鼠免疫毬蛋白可變區基因特徵,而SOST-scFv基因全長包括4箇框架區(FR)、3箇抗原互補決定區(CDR)以及具有抗體特徵性的2箇半胱氨痠殘基;本研究構建的scFv全長687箇堿基對,VL-Linker-VH為連接結構,SDS-PAGE分析錶明大腸桿菌錶達的scFv為可溶性蛋白,ELISA和West-blot檢測證實錶達scFv具有與SOST特異性結閤的活性,細胞實驗結果證實scFv能夠促進骨髓間充質細胞成骨分化及礦化結節的形成.結論 成功構建抗SOST單鏈抗體錶達載體,而且錶達的scFv產物具有確切的免疫結閤活性以及體外誘導成骨分化、礦化作用,為該抗體應用于骨質疏鬆疾病治療奠定瞭實驗基礎.
목적 구건항Sclerostin(SOST)단련항체원핵표체재체병대표체단백진행활성분석.방법 제취항SOST단극륭항체5H3D1잡교류세포총RNA,용RT-PCR방법확증항체경련가변구기인(VL)화중련가변구기인(VH)병통과중첩연신병접(SOE)PCR방법,재VL화VH기인지간인입Linker(Gly4Ser)3,련접성단련항체SOST-scFv(VL-Linker VH).장scFv기인극륭지표체재체PET-22b(+)후전입HEK293세포진행분비표체,취병희선알응효전영SDS-PAGE감정표체산물,ELISA화West-blot검측표체단백적반응활성,천소홍결절염색법평고단련항체대체외배양골수간충질간세포성골광화적영향.결과 VL기인서렬전장위339개감기대,VH기인서렬전장330개감기대,균부합소서면역구단백가변구기인특정,이SOST-scFv기인전장포괄4개광가구(FR)、3개항원호보결정구(CDR)이급구유항체특정성적2개반광안산잔기;본연구구건적scFv전장687개감기대,VL-Linker-VH위련접결구,SDS-PAGE분석표명대장간균표체적scFv위가용성단백,ELISA화West-blot검측증실표체scFv구유여SOST특이성결합적활성,세포실험결과증실scFv능구촉진골수간충질세포성골분화급광화결절적형성.결론 성공구건항SOST단련항체표체재체,이차표체적scFv산물구유학절적면역결합활성이급체외유도성골분화、광화작용,위해항체응용우골질소송질병치료전정료실험기출.
