CAJ | 학술논문

目的采用Gateway TM技术构建含大鼠尿素转运蛋白B(Urea transporter B,UT-B)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组腺病毒载体,并以该载体体外转染Caco-2细胞,观察Caco-2细胞内UT-B的表达.方法分别以pMD18-UT-B和IRES2-EGFP质粒为模板,PCR扩增UT-B和IRES-EGFP序列,通过引物重叠区进行PCR拼接,并在UT-B-IRES-EGFP两端引入attB1、attB2重组臂序列.PCR产物经BP重组系统将UT-B-IRES-EGFP融合基因重组到入门载体pDONR221中,构建入门克隆.入门克隆与表达载体pAD/CMV/V5-DEST使用LR重组系统进行体外重组,构建表达克隆pAD-UT-B-IRES-EGFP,pAD-UT-B-IRES-EGFP转化DH-5α,筛选阳性克隆,PCR及测序验证.pAD-UT-BIRES-EGFP用Pac I酶切线性化后由Lipofectamine 2000介导转染293A细胞,包装病毒,收集病毒液并测定滴度.重组的腺病毒体外感染培养的Caco-2细胞,RT-PCR观察Caco-2细胞中UT-B mRNA的表达.结果成功构建了pAD-UT-B-IRES-EGFP载体,经PCR及测序验证,表达载体包含UT-B基因,且序列与GeneBank中收录的大鼠UT-B序列一致.重组的腺病毒感染Caco-2细胞后可检测到UT-B mRNA的表达.结论利用GatewayTM系统成功构建了包含UT-B和IRES-EGFP的腺病毒表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础.
목적 채용Gateway TM기술구건함대서뇨소전운단백B(Urea transporter B,UT-B)화증강형록색형광단백(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)적중조선병독재체,병이해재체체외전염Caco-2세포,관찰Caco-2세포내UT-B적표체.방법분별이pMD18-UT-B화IRES2-EGFP질립위모판,PCR확증UT-B화IRES-EGFP서렬,통과인물중첩구진행PCR병접,병재UT-B-IRES-EGFP량단인입attB1、attB2중조비서렬.PCR산물경BP중조계통장UT-B-IRES-EGFP융합기인중조도입문재체pDONR221중,구건입문극륭.입문극륭여표체재체pAD/CMV/V5-DEST사용LR중조계통진행체외중조,구건표체극륭pAD-UT-B-IRES-EGFP,pAD-UT-B-IRES-EGFP전화DH-5α,사선양성극륭,PCR급측서험증.pAD-UT-BIRES-EGFP용Pac I매절선성화후유Lipofectamine 2000개도전염293A세포,포장병독,수집병독액병측정적도.중조적선병독체외감염배양적Caco-2세포,RT-PCR관찰Caco-2세포중UT-B mRNA적표체.결과성공구건료pAD-UT-B-IRES-EGFP재체,경PCR급측서험증,표체재체포함UT-B기인,차서렬여GeneBank중수록적대서UT-B서렬일치.중조적선병독감염Caco-2세포후가검측도UT-B mRNA적표체.결론이용GatewayTM계통성공구건료포함UT-B화IRES-EGFP적선병독표체재체,위진일보연구기공능전정료기출.