肿瘤基础与临床
腫瘤基礎與臨床
종류기출여림상
JOURNAL OF BASIC AND CLINICAL ONCOLOGY
2013年
5期
369-375
,共7页
祝峙%冯真%张晶%史敏%朱焱%郑建明
祝峙%馮真%張晶%史敏%硃焱%鄭建明
축치%풍진%장정%사민%주염%정건명
生长抑制因子1%p53%凋亡%细胞周期阻滞
生長抑製因子1%p53%凋亡%細胞週期阻滯
생장억제인자1%p53%조망%세포주기조체
目的 探讨生长抑制因子(ING1)调控p53信号通路诱导肝癌细胞凋亡的途径.方法 通过脂质体转染的方法在体外培养的肝癌细胞株HepG2中过表达ING1基因3种剪接变异体,采用流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡率和细胞周期变化,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测ING1、p53及其下游信号基因bcl-2、bax、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA和蛋白表达情况,荧光素酶双标报道基因检测下游p21waf1启动子活性,Western blot检测野生型p53蛋白半衰期变化,使用免疫共沉淀法(IP)观察ING1剪接体与mdm2、p14arf蛋白间的结合情况.结果 HepG2细胞转染过表达ING1不同剪接变异体,pcDNA3-ING1b[(24.36±0.97)%]和pcDNA3-ING1c[(27.33±1.12)%]组细胞凋亡率显著高于空载体组[(8.22%±0.86)%](P<0.01),而pcDNA3-ING1a组细胞凋亡率[(8.90±1.03)%]与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05).与空载体组比较,pcDNA3-ING1b和pcDNA3-ING1c组均出现G0/G1期阻滞(P<0.05);而pcDNA3-ING1a组各细胞周期的比例与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR及Western blot法结果显示过表达ING1b或ING1c使HepG2细胞内源性bax、p21waf1、p14arf mRNA及蛋白表达量明显增高(P<0.01);内源性bcl-2、mdm2 mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.01);过表达ING1a的HepG2细胞bax、bcl-2、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA及蛋白表达与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05).ING1b和ING1c增强p21waf1启动子活性,延长野生型p53蛋白的半衰期,促进p53蛋白乙酰化,并且与p53反馈调节环路基因mdm2和p14arf结合,维持p53蛋白的稳定性和促进p53蛋白的活性.结论 ING1剪接变异体通过与p53负反馈调节基因mdm2竞争性结合p53蛋白,延长野生型p53蛋白半衰期,并促进p53蛋白乙酰化,增强p53蛋白下游基因bax、p21waf1、p14arf表达,抑制bcl-2、mdm2基因表达,促进肝癌细胞凋亡.
目的 探討生長抑製因子(ING1)調控p53信號通路誘導肝癌細胞凋亡的途徑.方法 通過脂質體轉染的方法在體外培養的肝癌細胞株HepG2中過錶達ING1基因3種剪接變異體,採用流式細胞儀檢測各實驗組細胞凋亡率和細胞週期變化,實時熒光定量逆轉錄聚閤酶鏈式反應(RT-PCR)和Western blot法檢測ING1、p53及其下遊信號基因bcl-2、bax、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA和蛋白錶達情況,熒光素酶雙標報道基因檢測下遊p21waf1啟動子活性,Western blot檢測野生型p53蛋白半衰期變化,使用免疫共沉澱法(IP)觀察ING1剪接體與mdm2、p14arf蛋白間的結閤情況.結果 HepG2細胞轉染過錶達ING1不同剪接變異體,pcDNA3-ING1b[(24.36±0.97)%]和pcDNA3-ING1c[(27.33±1.12)%]組細胞凋亡率顯著高于空載體組[(8.22%±0.86)%](P<0.01),而pcDNA3-ING1a組細胞凋亡率[(8.90±1.03)%]與空載體組比較差異無統計學意義(P>0.05).與空載體組比較,pcDNA3-ING1b和pcDNA3-ING1c組均齣現G0/G1期阻滯(P<0.05);而pcDNA3-ING1a組各細胞週期的比例與空載體組比較差異無統計學意義(P>0.05).RT-PCR及Western blot法結果顯示過錶達ING1b或ING1c使HepG2細胞內源性bax、p21waf1、p14arf mRNA及蛋白錶達量明顯增高(P<0.01);內源性bcl-2、mdm2 mRNA及蛋白錶達量明顯降低(P<0.01);過錶達ING1a的HepG2細胞bax、bcl-2、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA及蛋白錶達與空載體組比較差異無統計學意義(P>0.05).ING1b和ING1c增彊p21waf1啟動子活性,延長野生型p53蛋白的半衰期,促進p53蛋白乙酰化,併且與p53反饋調節環路基因mdm2和p14arf結閤,維持p53蛋白的穩定性和促進p53蛋白的活性.結論 ING1剪接變異體通過與p53負反饋調節基因mdm2競爭性結閤p53蛋白,延長野生型p53蛋白半衰期,併促進p53蛋白乙酰化,增彊p53蛋白下遊基因bax、p21waf1、p14arf錶達,抑製bcl-2、mdm2基因錶達,促進肝癌細胞凋亡.
목적 탐토생장억제인자(ING1)조공p53신호통로유도간암세포조망적도경.방법 통과지질체전염적방법재체외배양적간암세포주HepG2중과표체ING1기인3충전접변이체,채용류식세포의검측각실험조세포조망솔화세포주기변화,실시형광정량역전록취합매련식반응(RT-PCR)화Western blot법검측ING1、p53급기하유신호기인bcl-2、bax、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA화단백표체정황,형광소매쌍표보도기인검측하유p21waf1계동자활성,Western blot검측야생형p53단백반쇠기변화,사용면역공침정법(IP)관찰ING1전접체여mdm2、p14arf단백간적결합정황.결과 HepG2세포전염과표체ING1불동전접변이체,pcDNA3-ING1b[(24.36±0.97)%]화pcDNA3-ING1c[(27.33±1.12)%]조세포조망솔현저고우공재체조[(8.22%±0.86)%](P<0.01),이pcDNA3-ING1a조세포조망솔[(8.90±1.03)%]여공재체조비교차이무통계학의의(P>0.05).여공재체조비교,pcDNA3-ING1b화pcDNA3-ING1c조균출현G0/G1기조체(P<0.05);이pcDNA3-ING1a조각세포주기적비례여공재체조비교차이무통계학의의(P>0.05).RT-PCR급Western blot법결과현시과표체ING1b혹ING1c사HepG2세포내원성bax、p21waf1、p14arf mRNA급단백표체량명현증고(P<0.01);내원성bcl-2、mdm2 mRNA급단백표체량명현강저(P<0.01);과표체ING1a적HepG2세포bax、bcl-2、p21waf1、mdm2、p14arf mRNA급단백표체여공재체조비교차이무통계학의의(P>0.05).ING1b화ING1c증강p21waf1계동자활성,연장야생형p53단백적반쇠기,촉진p53단백을선화,병차여p53반궤조절배로기인mdm2화p14arf결합,유지p53단백적은정성화촉진p53단백적활성.결론 ING1전접변이체통과여p53부반궤조절기인mdm2경쟁성결합p53단백,연장야생형p53단백반쇠기,병촉진p53단백을선화,증강p53단백하유기인bax、p21waf1、p14arf표체,억제bcl-2、mdm2기인표체,촉진간암세포조망.
