CAJ | 학술논문

目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽；构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达.方法:在NCBI Genebank和Olig0 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B)；通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(O、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定.结果:成功构建含有emml和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体；并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达；质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确.结论:成功构建A组p溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础.
목적:설계침대A조β용혈성련구균M1화M12단백적복합다태；구건함M단백기인(emm기인)1형화12형특이성항원결정족기인급기보수구J14태기인적GST표첨적중조표체재체;병유도화우화GST융합단백적표체.방법:재NCBI Genebank화Olig0 6인물설계연건중선택분별편마M단백emm기인1형화12형신호태후35개안기산급기상동적보수구14태기인서렬(전장270 bp),통과중첩PCR(Overlap PCR)합성소수적핵감산서렬,경측서학정서렬완전화설계적상필배후,장해중조편단극륭도pGEX-4T-1표체재체중,양성극륭경쌍매절화측서감정정학후건립은정표체해중조질립적대장간균BL21주계(pE/B)；통과취병희선알응효적고마사량람염색화Western blot래검측재불동시간(O、2、6、8、18화24소시)화온도(25℃、30℃화37℃)이급불동농도(0.01、0.1、1 mmol/L)이병기-β-D-류대필남반유당감(IPTG)유도GST융합단백(GST/emm)표체정황,병대유도표체적GST/emm절효진행질보분석감정.결과:성공구건함유emml화emm12항원결정족급M단백보수구J14태기인적원핵표체재체；병유도기은정표체,재1 mol/L IPTG유도6～8소시체고봉,불동온도하균유과량표체；질보검측유도단백GST/emm조대결과정학.결론:성공구건A조p용혈성련구균적emm1형화emm12형원핵표체재체,병은정유도GST/emm표체,위하일보연구GST/emm적순화、매절이급면역원성적감정화역묘연제타하항실적기출.