中国免疫学杂志
中國免疫學雜誌
중국면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF IMMUNOLOGY
2013年
3期
271-278
,共8页
马佳佳%Nick Lu%陈必良%滑玮%张建芳
馬佳佳%Nick Lu%陳必良%滑瑋%張建芳
마가가%Nick Lu%진필량%활위%장건방
白细胞介素12%妊娠%哮喘%辅助性T细胞17型%真核表达%免疫耐受
白細胞介素12%妊娠%哮喘%輔助性T細胞17型%真覈錶達%免疫耐受
백세포개소12%임신%효천%보조성T세포17형%진핵표체%면역내수
目的:构建携带IL-12重组基因的真核表达载体,探讨其对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的免疫调节作用及其可能机制.方法:PCR扩增mIL-12基因cDNA,利用DNA重组技术将线性化片段定向插入载体pcDNA3.1(+)质粒中,经酶切和测序鉴定,通过脂质体介导瞬时转染P815细胞,观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位.以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立妊娠期哮喘小鼠模型,通过气道内灌注:妊娠期哮喘(AP)+ pcDNA3.1(+)-mIL-12组(AP1组)、单纯哮喘(ANP)+ pcD-NA3.1(+)-mIL-12组(ANP1组)给予50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/脂质体混合液；AP+ pcDNA3.1(+)组(AP2组)、ANP+pcDNA3.1(+)组(ANP2组)给予50μl pcDNA3.1(+)/脂质体混合液；单纯妊娠组(HP组)、阴性对照组(HNP组)给予50μlPBS.于末次激发24小时后,观察肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞计数及肺组织HE染色以评价小鼠气道炎症程度；RT-PCR、Western blot鉴定小鼠肺组织匀浆中IL-12蛋白及mRNA表达；流式细胞术检测小鼠脾细胞IL-17+及IFN-γ+分泌水平；ELISA测定小鼠外周血上清中细胞因子含量变化.结果:成功构建重组pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达载体,并在P815细胞中获得高效表达.与HP、HNP组相比,AP1、ANP1组BALF中白细胞总数及Eos,Neu,Lym占细胞总数百分比均显著低于AP2、ANP2组,但高于HP和HNP组,AP1与ANP1组间尤以AP1组降低显著(P＜0.05),且肺组织炎症细胞浸润明显减轻,炎症反应明显轻微.肺组织标本中,AP1、ANP1组IL-12蛋白含量及mRNA表达水平在重组质粒干预后显著高于AP2、ANP2组.脾组织标本中AP1、ANP1组IFN-γ+含量明显升高,而CD4+ IL-17+明显降低(P＜ 0.05)；IFN-γ+与CD4+ IL-17+比例高于AP2、ANP2组(P＜0.05)；此变化趋势AP1组比ANP1组更为明显(P ＜0.05)；HP组IFN-γ+及IL-17+含量变化与HNP组组间差异不显著.外周血上清中细胞因子检测结果AP1、ANP1组IFN-γ明显升高,IL-4、IL-17显著降低(P＜0.05).结论:构建的pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达载体能够在明显改善妊娠期哮喘小鼠气道炎症反应的同时上调IFN-γ表达,使Th2、Th17型细胞分化和增殖功能受抑,证实IL-12表达上调参与了妊娠期哮喘的发生发展.
目的:構建攜帶IL-12重組基因的真覈錶達載體,探討其對妊娠期哮喘小鼠氣道炎癥的免疫調節作用及其可能機製.方法:PCR擴增mIL-12基因cDNA,利用DNA重組技術將線性化片段定嚮插入載體pcDNA3.1(+)質粒中,經酶切和測序鑒定,通過脂質體介導瞬時轉染P815細胞,觀察熒光蛋白在細胞中的錶達和定位.以鷄卵清蛋白(OVA)緻敏和激髮建立妊娠期哮喘小鼠模型,通過氣道內灌註:妊娠期哮喘(AP)+ pcDNA3.1(+)-mIL-12組(AP1組)、單純哮喘(ANP)+ pcD-NA3.1(+)-mIL-12組(ANP1組)給予50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/脂質體混閤液；AP+ pcDNA3.1(+)組(AP2組)、ANP+pcDNA3.1(+)組(ANP2組)給予50μl pcDNA3.1(+)/脂質體混閤液；單純妊娠組(HP組)、陰性對照組(HNP組)給予50μlPBS.于末次激髮24小時後,觀察肺泡灌洗液(BALF)炎性細胞計數及肺組織HE染色以評價小鼠氣道炎癥程度；RT-PCR、Western blot鑒定小鼠肺組織勻漿中IL-12蛋白及mRNA錶達；流式細胞術檢測小鼠脾細胞IL-17+及IFN-γ+分泌水平；ELISA測定小鼠外週血上清中細胞因子含量變化.結果:成功構建重組pcDNA3.1(+)-mIL-12真覈錶達載體,併在P815細胞中穫得高效錶達.與HP、HNP組相比,AP1、ANP1組BALF中白細胞總數及Eos,Neu,Lym佔細胞總數百分比均顯著低于AP2、ANP2組,但高于HP和HNP組,AP1與ANP1組間尤以AP1組降低顯著(P＜0.05),且肺組織炎癥細胞浸潤明顯減輕,炎癥反應明顯輕微.肺組織標本中,AP1、ANP1組IL-12蛋白含量及mRNA錶達水平在重組質粒榦預後顯著高于AP2、ANP2組.脾組織標本中AP1、ANP1組IFN-γ+含量明顯升高,而CD4+ IL-17+明顯降低(P＜ 0.05)；IFN-γ+與CD4+ IL-17+比例高于AP2、ANP2組(P＜0.05)；此變化趨勢AP1組比ANP1組更為明顯(P ＜0.05)；HP組IFN-γ+及IL-17+含量變化與HNP組組間差異不顯著.外週血上清中細胞因子檢測結果AP1、ANP1組IFN-γ明顯升高,IL-4、IL-17顯著降低(P＜0.05).結論:構建的pcDNA3.1(+)-mIL-12真覈錶達載體能夠在明顯改善妊娠期哮喘小鼠氣道炎癥反應的同時上調IFN-γ錶達,使Th2、Th17型細胞分化和增殖功能受抑,證實IL-12錶達上調參與瞭妊娠期哮喘的髮生髮展.
목적:구건휴대IL-12중조기인적진핵표체재체,탐토기대임신기효천소서기도염증적면역조절작용급기가능궤제.방법:PCR확증mIL-12기인cDNA,이용DNA중조기술장선성화편단정향삽입재체pcDNA3.1(+)질립중,경매절화측서감정,통과지질체개도순시전염P815세포,관찰형광단백재세포중적표체화정위.이계란청단백(OVA)치민화격발건립임신기효천소서모형,통과기도내관주:임신기효천(AP)+ pcDNA3.1(+)-mIL-12조(AP1조)、단순효천(ANP)+ pcD-NA3.1(+)-mIL-12조(ANP1조)급여50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/지질체혼합액；AP+ pcDNA3.1(+)조(AP2조)、ANP+pcDNA3.1(+)조(ANP2조)급여50μl pcDNA3.1(+)/지질체혼합액；단순임신조(HP조)、음성대조조(HNP조)급여50μlPBS.우말차격발24소시후,관찰폐포관세액(BALF)염성세포계수급폐조직HE염색이평개소서기도염증정도；RT-PCR、Western blot감정소서폐조직균장중IL-12단백급mRNA표체；류식세포술검측소서비세포IL-17+급IFN-γ+분비수평；ELISA측정소서외주혈상청중세포인자함량변화.결과:성공구건중조pcDNA3.1(+)-mIL-12진핵표체재체,병재P815세포중획득고효표체.여HP、HNP조상비,AP1、ANP1조BALF중백세포총수급Eos,Neu,Lym점세포총수백분비균현저저우AP2、ANP2조,단고우HP화HNP조,AP1여ANP1조간우이AP1조강저현저(P＜0.05),차폐조직염증세포침윤명현감경,염증반응명현경미.폐조직표본중,AP1、ANP1조IL-12단백함량급mRNA표체수평재중조질립간예후현저고우AP2、ANP2조.비조직표본중AP1、ANP1조IFN-γ+함량명현승고,이CD4+ IL-17+명현강저(P＜ 0.05)；IFN-γ+여CD4+ IL-17+비례고우AP2、ANP2조(P＜0.05)；차변화추세AP1조비ANP1조경위명현(P ＜0.05)；HP조IFN-γ+급IL-17+함량변화여HNP조조간차이불현저.외주혈상청중세포인자검측결과AP1、ANP1조IFN-γ명현승고,IL-4、IL-17현저강저(P＜0.05).결론:구건적pcDNA3.1(+)-mIL-12진핵표체재체능구재명현개선임신기효천소서기도염증반응적동시상조IFN-γ표체,사Th2、Th17형세포분화화증식공능수억,증실IL-12표체상조삼여료임신기효천적발생발전.
