中华临床医师杂志（电子版）
中華臨床醫師雜誌（電子版）
중화림상의사잡지（전자판）
CHINESE JOURNAL OF CLINICIANS(ELECTRONIC VERSION)
2012年
20期
37-39
,共3页
金博%李楠%吴凯%张林%王艳梅%翟俊山%朱超慧%宋久刚
金博%李楠%吳凱%張林%王豔梅%翟俊山%硃超慧%宋久剛
금박%리남%오개%장림%왕염매%적준산%주초혜%송구강
肝炎病毒属%病毒非结构蛋白质类%重组蛋白质类
肝炎病毒屬%病毒非結構蛋白質類%重組蛋白質類
간염병독속%병독비결구단백질류%중조단백질류
Hepacivirus%Viral nonstructural proteins%Recombinant proteins
目的 构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白.方法 克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的Bam H1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Western blot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量.收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中.释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素.结果 用此方法克隆的HCV NS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69 kD.含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上.此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40 mg.内毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具.
目的 構建丙型肝炎病毒非結構蛋白3(HCV NS3)錶達質粒併在大腸桿菌中錶達其全長蛋白.方法 剋隆HCV NS3的覈痠序列3420-5312位點,插入pQE-11質粒的Bam H1限製性酶切位點,將此重組質粒轉入大腸桿菌錶達,用Western blot方法篩選暘性剋隆,將含有額外拷貝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA質粒引入HCV NS3錶達繫統以提高HCV NS3蛋白的錶達量.收集培養擴增的大腸桿菌菌體,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重組蛋白的不溶性包涵體,將包涵體充分洗滌後,溶于含10 mmol/L二硫囌糖醇的緩遲液中.釋放的可溶性蛋白用SDS-PAGE電泳分離、洗脫,用離心過濾方法濃縮,乙醇沉澱,重複洗滌去除內毒素.結果 用此方法剋隆的HCV NS3全長基因片段錶達的重組蛋白分子量為69 kD.含有額外拷貝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA質粒引入HCV NS3錶達繫統後,HCV NS3蛋白的產齣率可提高10倍以上.此方法生產的NS3純化蛋白質產量,每升培養物為40 mg.內毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.結論 HCV NS3與HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切關繫,是HCV的抗病毒治療和疫苗研究的重要靶點,全長HCV NS3蛋白的體外閤成為HCV研究提供瞭一箇有用的工具.
목적 구건병형간염병독비결구단백3(HCV NS3)표체질립병재대장간균중표체기전장단백.방법 극륭HCV NS3적핵산서렬3420-5312위점,삽입pQE-11질립적Bam H1한제성매절위점,장차중조질립전입대장간균표체,용Western blot방법사선양성극륭,장함유액외고패적argU、ileY화leuW적tRNA기인적pACYA질립인입HCV NS3표체계통이제고HCV NS3단백적표체량.수집배양확증적대장간균균체,용란백용균매렬해,수집함유HCV NS3중조단백적불용성포함체,장포함체충분세조후,용우함10 mmol/L이류소당순적완충액중.석방적가용성단백용SDS-PAGE전영분리、세탈,용리심과려방법농축,을순침정,중복세조거제내독소.결과 용차방법극륭적HCV NS3전장기인편단표체적중조단백분자량위69 kD.함유액외고패적argU、ileY화leuW적tRNA기인적pACYA질립인입HCV NS3표체계통후,HCV NS3단백적산출솔가제고10배이상.차방법생산적NS3순화단백질산량,매승배양물위40 mg.내독소함량저우20 EU/mg NS3단백.결론 HCV NS3여HCV적면역도일급감염적만성화유밀절관계,시HCV적항병독치료화역묘연구적중요파점,전장HCV NS3단백적체외합성위HCV연구제공료일개유용적공구.
