中国病理生理杂志
中國病理生理雜誌
중국병리생리잡지
CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY
2013年
4期
577-583
,共7页
钟华%龚艳%吴玲玲%赵慧%王静%孙志萍%邓峰美%何芳
鐘華%龔豔%吳玲玲%趙慧%王靜%孫誌萍%鄧峰美%何芳
종화%공염%오령령%조혜%왕정%손지평%산봉미%하방
小凹蛋白-1%人脐静脉内皮细胞%受体,钙敏感%钙信号
小凹蛋白-1%人臍靜脈內皮細胞%受體,鈣敏感%鈣信號
소요단백-1%인제정맥내피세포%수체,개민감%개신호
目的:研究小凹蛋白-1(Cav-1)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞外钙敏感受体(CaR)介导钙内流的作用机制.方法:取2～3代HUVECs,采用细胞膜穴样凹陷(caveolae)结构破坏剂非律平(filipin)和甲基-β-环糊精(MβCD)及Cav-1基因沉默,配合CaR激动剂精胺(spermine)和负性变构调节剂Calhex 231.Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i).Western blotting检测HUVECs中Cav-1以及CaR蛋白表达,免疫共沉淀技术检测Cav-1和CaR相互作用.用蔗糖密度梯度离心的方法提取并鉴定caveolae,Western blotting检测caveolae的标志蛋白Cav-1和浮舰蛋白1(flotillin-1)及CaR表达.同时检测胞膜、胞浆和高尔基体标志蛋白:转铁蛋白受体(TfR)、β-肌动蛋白(β-actin)和β-外被体蛋白(β-COP).检测富含Cav-1膜(CEM)区、非caveolae Ⅰ区(NCF Ⅰ)和Ⅱ区(NCF Ⅱ)的Cav-1和CaR表达.结果:(1)细胞外液为含钙液时,Calhex 231完全阻断精胺刺激引起的[Ca2+]i升高(P＜0.05),MβCD可加强精胺升高[Ca2+]i的作用(P＜0.05).不同浓度MβCD处理后各组Cav-1和CaR相互作用的差异无统计学意义(P＞0.05)；(2)免疫共沉淀结果显示,各组Cav-1和CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P＞0.05)；(3)与control组比较,spermine+ Ca2+组、filipin+ spermine+Ca2+组和MβCD+ spermine+ Ca2+组CEM区的Cav-1和CaR蛋白表达均降低(P＜0.05),NCF Ⅰ区的Cav-1和CaR蛋白表达增加(P＜0.05),NCF Ⅱ区Cav-1蛋白表达增加(P＜0.05),而CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:在HUVECs中,Cav-1和CaR共定位于同一caveolae区,同时Cav-1对CaR介导的Ca2内流有下调作用,其机制可能与Cav-1抑制CaR膜定位、促使其向非caveolae区转位及减弱其对激动剂的反应性有关.
目的:研究小凹蛋白-1(Cav-1)對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)細胞外鈣敏感受體(CaR)介導鈣內流的作用機製.方法:取2～3代HUVECs,採用細胞膜穴樣凹陷(caveolae)結構破壞劑非律平(filipin)和甲基-β-環糊精(MβCD)及Cav-1基因沉默,配閤CaR激動劑精胺(spermine)和負性變構調節劑Calhex 231.Fura-2/AM負載檢測細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i).Western blotting檢測HUVECs中Cav-1以及CaR蛋白錶達,免疫共沉澱技術檢測Cav-1和CaR相互作用.用蔗糖密度梯度離心的方法提取併鑒定caveolae,Western blotting檢測caveolae的標誌蛋白Cav-1和浮艦蛋白1(flotillin-1)及CaR錶達.同時檢測胞膜、胞漿和高爾基體標誌蛋白:轉鐵蛋白受體(TfR)、β-肌動蛋白(β-actin)和β-外被體蛋白(β-COP).檢測富含Cav-1膜(CEM)區、非caveolae Ⅰ區(NCF Ⅰ)和Ⅱ區(NCF Ⅱ)的Cav-1和CaR錶達.結果:(1)細胞外液為含鈣液時,Calhex 231完全阻斷精胺刺激引起的[Ca2+]i升高(P＜0.05),MβCD可加彊精胺升高[Ca2+]i的作用(P＜0.05).不同濃度MβCD處理後各組Cav-1和CaR相互作用的差異無統計學意義(P＞0.05)；(2)免疫共沉澱結果顯示,各組Cav-1和CaR蛋白錶達的差異無統計學意義(P＞0.05)；(3)與control組比較,spermine+ Ca2+組、filipin+ spermine+Ca2+組和MβCD+ spermine+ Ca2+組CEM區的Cav-1和CaR蛋白錶達均降低(P＜0.05),NCF Ⅰ區的Cav-1和CaR蛋白錶達增加(P＜0.05),NCF Ⅱ區Cav-1蛋白錶達增加(P＜0.05),而CaR蛋白錶達的差異無統計學意義(P＞0.05).結論:在HUVECs中,Cav-1和CaR共定位于同一caveolae區,同時Cav-1對CaR介導的Ca2內流有下調作用,其機製可能與Cav-1抑製CaR膜定位、促使其嚮非caveolae區轉位及減弱其對激動劑的反應性有關.
목적:연구소요단백-1(Cav-1)대인제정맥내피세포(HUVECs)세포외개민감수체(CaR)개도개내류적작용궤제.방법:취2～3대HUVECs,채용세포막혈양요함(caveolae)결구파배제비률평(filipin)화갑기-β-배호정(MβCD)급Cav-1기인침묵,배합CaR격동제정알(spermine)화부성변구조절제Calhex 231.Fura-2/AM부재검측세포내Ca2+농도([Ca2+]i).Western blotting검측HUVECs중Cav-1이급CaR단백표체,면역공침정기술검측Cav-1화CaR상호작용.용자당밀도제도리심적방법제취병감정caveolae,Western blotting검측caveolae적표지단백Cav-1화부함단백1(flotillin-1)급CaR표체.동시검측포막、포장화고이기체표지단백:전철단백수체(TfR)、β-기동단백(β-actin)화β-외피체단백(β-COP).검측부함Cav-1막(CEM)구、비caveolae Ⅰ구(NCF Ⅰ)화Ⅱ구(NCF Ⅱ)적Cav-1화CaR표체.결과:(1)세포외액위함개액시,Calhex 231완전조단정알자격인기적[Ca2+]i승고(P＜0.05),MβCD가가강정알승고[Ca2+]i적작용(P＜0.05).불동농도MβCD처리후각조Cav-1화CaR상호작용적차이무통계학의의(P＞0.05)；(2)면역공침정결과현시,각조Cav-1화CaR단백표체적차이무통계학의의(P＞0.05)；(3)여control조비교,spermine+ Ca2+조、filipin+ spermine+Ca2+조화MβCD+ spermine+ Ca2+조CEM구적Cav-1화CaR단백표체균강저(P＜0.05),NCF Ⅰ구적Cav-1화CaR단백표체증가(P＜0.05),NCF Ⅱ구Cav-1단백표체증가(P＜0.05),이CaR단백표체적차이무통계학의의(P＞0.05).결론:재HUVECs중,Cav-1화CaR공정위우동일caveolae구,동시Cav-1대CaR개도적Ca2내류유하조작용,기궤제가능여Cav-1억제CaR막정위、촉사기향비caveolae구전위급감약기대격동제적반응성유관.
